Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «вектор» Информационный мониторинг эпидемиологической ситуации по оови в мире и России Бюллетень №5
Скачать 0.84 Mb.
|
3 Разработка новых противовирусных молекул в качестве средства лечения инфекции Эбола Несмотря на то, что вирус Эбола был идентифицирован как причина многих смертельной вспышек геморрагической лихорадки за более чем три десятилетия, современные возможности лечения инфицированных людей ограничены. Такие недоработанные методы как введение сыворотки выздоравливающих людей, выживших после инфекции [99], или анти-Эбола иммуноглобулина лошадей с IFN [100] успешно использовались для уменьшения тяжести инфекции (Рис. 4a). Хотя каждый человек, получивший эти препараты выжил, механизм защиты неясен, так как состав каждого продукта был сложным и один специфический компонент не мог быть воспроизводимо связан с выживанием. Например, первоначально считалось, что анти-Эбола IgG обеспечил защиту восьми больных геморрагической лихорадкой Эбола, которые выжили после введения цельной крови, достоверно содержавшей анти-EBOV антитела IgG [101]. Хотя эта связь казалась логичной и ясной, ее не удалось успешно воспроизвести в контролируемых лабораторных условиях. В исследовании, проведенном Ярлингом и др., у наивных макак-резусов, которым ввели цельную кровь, взятую в фазе выздоровления от трех макак, выживших после заражения EBOV, выработались заметные титры сывороточных анти-EBOV антител IgG [102]. Однако этого было недостаточно для контроля репликации вируса, и заболевание у этих животных прогрессировало подобно непролеченным макакам. Эффективность хорошо охарактеризованного человеческого анти-EBOV моноклонального антитела (KZ52) была оценена на морских свинках и НЧП (Таблицы 2, 3) [103]. Хотя это антитело имело зарегистрированную 50% ингибирующую концентрацию (IC50), равную 0,5-2 мкг/мл, in vitro и in vivo, введение дозы 25 мг/кг через 1 ч после заражения EBOV обеспечивало лишь частичную защиту морских свинок (9 из 15). Этот препарат также не контролировал репликацию вируса и не защищал НЧП в дозе 50 мг/кг [103]. Дополнительные детальные молекулярные исследования показали, что моноклональные нейтрализующие антитела взаимодействуют с GP вируса Эбола на различных участках, и сочетания моноклональных изолятов наиболее эффективны для применения до и после заражения [104–107]. Как только стало ясно, что непосредственный перенос иммунитета от инфицированных выживших животных оказался ненадежным методом борьбы с инфекцией Эбола, были начаты крупномасштабные многоцентровые совместные исследовательские проекты по скринингу библиотек хорошо охарактеризованных и новых соединений для выявления клеточных и молекулярных мишеней, связанных с вхождением и репликацией вируса. Соединения, оцененные на данный момент у грызунов и НЧП, указаны в Таблицах 2 и 3. Таблица 2 Противовирусные соединения, протестированные на данный момент на моделях инфекции Эбола с использованием грызунов
МТ – масса тела, c3-NpcA – 3-деазанпланоцин A, Ca-c3 Ado – карбоциклический 3-деазанаденозин, GP –гликопротеин Таблица 3 Противовирусные соединения, протестированные на данный момент на моделях инфекции Эбола с использованием нечеловекообразных приматов
МТ – масса тела, GP –гликопротеин, LNP – липидная наночастица 3.1 Мелкомолекулярные ингибиторы вхождения вируса и выхода из эндосом Вхождение вируса является важным этапом жизненного цикла вируса и часто служит привлекательной мишенью для терапии, так как ингибирование этого процесса блокирует репликацию на ранней стадии, что значительно снижает вероятность развития лекарственной устойчивости вируса. Анализы на основе высокопроизводительного скрининга клеток (HTS), проводимые с использованием зеленого флуоресцентного белка, экспрессирующего рекомбинантный EBOV, или рекомбинантных псевдотипированных вирусов с нанесенным на них GP EBOV, которые не требуют высокого уровня изоляции, использовались для идентификации белков, опосредующих вхождение филовирусов [108]. Этот подход, используемый в сочетании со структурным анализом GP вируса Эбола, привел к открытию нескольких малых молекул, которые могут оказаться полезными терапевтическими средствами против геморрагической лихорадки Эбола. Производное бензодиазепина (соединение 7) было идентифицировано в результате HTS библиотек новых молекул как соединение, которое может предотвращать заражение рекомбинантным вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), псевдотипированным с помощью GP EBOV (HIV/EBOV-GP) [109]. Компьютерный анализ кристаллической структуры GP EBOV впоследствии применялся для изучения взаимодействия соединения 7 с вирусом. Результаты этого исследования показали, что соединение 7 может помещаться в гидрофобном кармане между субъединицами GP1 и GP2 таким образом, что это могло бы помешать вхождению вируса (Рис. 4a).  Рис. 4 Общие мишени для малых молекул при лечении инфекции Эбола. a Первые попытки смягчить развитие инфекции Эбола включали введение сыворотки, взятой от выздоравливающих выживших. Умеренный успех, достигнутый с использованием этого подхода, привел к разработке моноклональных антител (МКА), специфичных для гликопротеина (GP) вируса Эбола, который теоретически должен предотвращать вхождение вируса в клеточные мишени. Дополнительные исследования показали, что поликлональные антитела или сочетания моноклональных изолятов, способные взаимодействовать с GP Эбола в нескольких участках, наиболее эффективны для лечения до и после заражения. Высокопроизводительный скрининг выявил одну молекулу, соединение 7, которое могло предотвращать вхождение вируса in vitro. Компьютерный анализ показал, что он помещается в кармане тримера GP1,2. b Выход из эндосом. Высокопроизводительные анализы выявили несколько соединений, эффективных в предотвращении выхода вирусной частицы из эндосомы. Другие процедуры скрининга в целях выявления белков хозяина, взаимодействующих с вирусом Эбола во время инфекции, привели к разработке «молчащих» технологий, которые делают эти белки недоступными для предотвращения выхода вирусных частиц из эндосом. c Репликация, почкование и высвобождение вируса. Соединения, продемонстрировавшие эффективность в прекращении репликации вируса Эбола, нацелены на различные компоненты рибонуклеопротеинового (RNP) комплекса. Соединения, нацеленные на вирионный белок (VP)-40 и VP24, влияют на клеточный транспорт вирусной частицы и почкование и высвобождение из клетки-хозяина. Fc- кристаллизующийся фрагмент, ВИЧ вирус иммунодефицита человека, Tat трансактиватор транскрипции Вирус Эбола должен также близко взаимодействовать с многочисленными белками хозяина во время процессов выхода из эндосом, репликации, сборки, почкования и высвобождения. HTS также выявил соединение, производное от бензилпиперазин адамантин диамина (2 - ((3r,5r,7r)-адамантан-1-ил)-N-(2 - (4-бензилпиперазин-1-ил)-2-оксоэтил)-ацетамид), известное как соединение 3.47, которое подавляет вызываемую EBOV инфекцию in vivo [110]. Биохимические исследования показали, что эта молекула связывается с Niemann-Pick C1 (NPC1), белком-транспортером холестерина, отвечающим за удаление холестерина из поздних эндосом/лизосом и внутриклеточный гомеостаз холестерина [111]. Дальнейший анализ этого и других химически сходных соединений показал, что данный белок, который опосредует разрушительное нейродегенеративное состояние, болезнь Нимана-Пика типа C, также играет определенную роль во вхождении EBOV [112, 113]. Аналогично, усилия по характеризации взаимодействий между EBOV и белком хозяина позволили идентифицировать две новые молекулы –Δ-пептид EBOV, конъюгированный с кристаллизующимся участком (Fc) фрагмента человеческого антитела IgG1, и нацеленный на эндосому C-пептид, полученный из повторяющихся участков нативного C-концевого гептада GP2 EBOV, конъюгированного с богатой аргинином последовательностью трансактиватора транскрипции (Tat) ВИЧ-1, в качестве перспективных кандидатов для предотвращения высвобождения вируса из эндосомы (Рис. 4b) [114]. Несколько противоположным образом, Спургерс и др. [115] идентифицировали несколько белков хозяина [включая белок теплового шока 70 кДа 5 (HSPA5) и рибосомальный белок L18 (RPL18)] с помощью жидкостной хроматографии-связанной тандемной масс-спектрометрии, которые играли ключевую роль в репликации вируса Эбола, и подтвердили свои данные с использованием последовательности миРНК для нацеливания на экспрессию белка хозяина. Различные ингибиторы протеаз были также оценены как потенциальные противовирусные соединения против EBOV. Эта стратегия основана на том, что GP EBOV перерабатывается эндосомными цистеинпротеазами – катепсином, CatB и CatL [116–118]. Добавление ингибиторов цистеинпротеаз E64 и CA074 в культуральную среду эффективно блокировало клеточные катепсины и подавляло репликацию EBOV и вызванные вирусом цитопатические эффекты in vitro [117]. Эти соединения также продемонстрировали противовирусную активность в отношении многих других вирусов (Марбург, лихорадки долины Рифт, Ласса) in vitro и защищали мышей от заражения адаптированным к мышам EBOV при введении их в качестве профилактического (80%) или постконтактного терапевтического средства (50%) (Рис. 4b). 3.2 Соединения, блокирующие репликацию вируса На протяжении многих лет рибавирин – распространенный противовирусный препарат, который препятствует репликации многих РНК-содержащих вирусов, например, гриппа и полиомиелита, способствуя повышению частоты мутаций в вирусном геноме («катастрофа ошибок»), а также через другие вспомогательные механизмы – применялся для лечения геморрагической лихорадки [119]. Несмотря на успешное применение для смягчения геморрагических лихорадок, вызываемых аренавирусами и буньявирусами [120, 121], рибавирин не контролировал репликацию EBOV и не мог защитить животных от смертельного заражения. Альтернативой этому подходу является блокирование транскрипции и/или репликации вируса с помощью антисмысловых олигонуклеотидов, комплементарных последовательностям в геноме EBOV или в комплексе РНК-полимеразы (Рис. 4c) [122, 123]. Гейсберт и др. [123] выявили миРНК, которые специфически связываются с последовательностями в участках полимеразы EBOV L (EK-1), VP24 (VP-24-1160) и VP35 (VP-35-855). Когда эти соединения объединили и сформулировали как стабильные частицы, состоящие из нуклеиновых кислот и липидов (SNALP; LNP/siRNA: TKM-Ebola), а затем ввели НЧП каждое в виде четырех отдельных доз по 2 мг/кг внутривенно, 66% популяции выжило после смертельного заражения EBOV (Таблица 3). Схема введения в виде семи доз эффективно прекращала размножение вируса, при этом отмечалось умеренное повышение сывороточных уровней аспартатаминотрансферазы. Все животные, получившие препарат по этой схеме, выжили после заражения. Аналогично, с-ABL1 и родственные тирозинкиназы, которые, как известно, влияют на репликацию некоторых ДНК-вирусов и бактерий, были оценены с точки зрения их роли в репликации EBOV. Ряд «молчащих» исследований выявил, что фосфорилирование белка VP40 под действием с-ABL1 необходимо для транспортировки нуклеокапсидного комплекса к клеточной мембране и высвобождения полных вирионов из клетки [124]. Блокирование этого процесса с помощью таких соединений, одобренных для лечения лейкемии у людей, как иматиниб (Gleevec®) и нилотиниб (Tasigna®), нацеленных на этот фермент, существенно ограничивало количество инфекционных вирионов Эбола, высвобождаемых в культуральную среду (Рис. 4c) [124]. Использование соединений, нацеленных на генные продукты хозяина, вместо самого вируса в более крупных моделях инфекции Эбола может эффективно предотвращать развитие лекарственно-устойчивых мутантов с течением времени. Еще одна терапевтическая платформа, перспективная для предотвращения репликации EBOV, включает использование синтетических антисмысловых олигонуклеотидов третьего поколения - фосфородиамидат морфолино олигомеров (ФМО), которые являются некомпетентными по РНКазе Н и останавливают трансляцию и процессинг мРНК через стерические препятствия [125]. Эти молекулы, в которых кольца рибозы заменены на шестичленные кольца морфолина, а традиционные фосфодиэфирные связи заменены на фосфородиамидатные связи, демонстрируют повышенную растворимость и химически более стабильны в биологических жидкостях и при хранении по сравнению с первым поколением [126]. Ряд недавних отчетов показал, что эти молекулы могут быть ценными терапевтическими препаратами для лечения филовирусной инфекции [115, 127– 129]. Введение положительно заряженных ФМО, специфичных для EBOV (AVI-6002), нацеленных на последовательности мРНК в участках VP24 и VP35 через 30-60 мин после заражения подавляло репликацию вируса и последующие воспалительные реакции, а также полностью защищало пять из восьми макак (Рис. 4c, Табл. 3) [130]. Постконтактное введение специфичных для вируса Марбург ФМО (AVI-6003), нацеленных на VP24, VP35 и белок L MARV, также полностью защищало НЧП от смертельного заражения [130]. Несмотря на то, что в Управление по контролю качества пищевых продуктов и медикаментов США подана заявка на рассмотрение в качестве Нового исследуемого препарата и проводятся клинические испытания фазы I по оценке безопасности этих соединений [126], необходимо провести дополнительные исследования, чтобы точно определить временные рамки, в которых они обеспечивают защиту после воздействия, прежде чем они смогут использоваться в постконтактных терапевтических схемах. Высокопроизводительные системы скрининга также позволили идентифицировать три мелкомолекулярные ингибитора инфекции EBOV: FGI-103 [131], FGI-104 [132] и FGI-106 [133]. Эти соединения обеспечивали 80-100% защиту мышей, зараженных EBOV (Табл. 2). Хотя механизмы противовирусной активности FGI-103 и FGI-104 окончательно не выяснены, широкая активность FGI-106 против вирусов Эбола, Марбург, лихорадки долины Рифт, Денге, ВИЧ и гепатита C позволяет предположить, что это соединение нацелено на клеточный путь хозяина, вовлеченный в процесс репликации разнообразных вирусов и являющийся общим для них. |
Похожие:
 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «вектор»... Геморрагическая лихорадка Эбола в Юго-Западной Африке (Ситуация на 21. 04. 2014 года) | | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «вектор»... Сообщение от президента Медицинского отделения Техасского университета 23 марта 2013 года |
| Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «вектор»... Двадцать четыре (24) пациента в настоящее время находятся в Центрах лечения evd: Конакри (6), Guéckédou (9), Telimele (3) и Boffa... | | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «вектор»... Оперативная информация о болезни, вызванной вирусом Эбола (бввэ) в Западной Африке на сайте воз |
| Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «вектор»... Каскадная регуляция экспрессии генов вируса осповакцины модулируется многоступенчатыми промоторами. Yang Z, Maruri-Avidal L, Sisler... | | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «вектор»... Заявление воз по итогам совещания Комитета Международных медико-санитарных правил по чрезвычайной ситуации в отношении вспышки Эболы... |
| Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «вектор»... Компания Bavarian Nordic получает разрешение на продажу оспенной вакцины imvanex в Европе (Bavarian Nordic Receives European Marketing... | | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «вектор»... Эбола (бввэ), 171 из которых закончился смертельным исходом. Со времени последней сводки от 9 мая 2014 г произошло 5 новых случаев... |
| Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «вектор»... Юго-Восточной Гвинеи (районы Гуэкеду, Масента и Киссидугу). Семеро заболевших в настоящее время проходят лечение в изоляторах района... | | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «вектор»... «Ликвидация оспы: уничтожение запасов вируса натуральной оспы». В подготовленном к сессии докладе Секретариата воз2 представлена... |
| Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики... Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»... |  | 29 марта 2012 года Дата введения Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"; Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Противочумный... |
| Информационный бюллетень №15 (конкурсы, гранты, конференции) Ноябрь 2006 Содержание: «Горящие» Центрально-черноземный региональный информационный центр научно-технологического сотрудничества с ес | | Информационный бюллетень №10. (конкурсы, гранты, конференции) Июнь... Центрально-черноземный региональный информационный центр по научно-технологическому сотрудничеству с ес |
| Информационный бюллетень №13. (конкурсы, гранты, конференции) Сентябрь... Центрально-черноземный региональный информационный центр по научно-технологическому сотрудничеству с ес | | Информационный бюллетень №7. (конкурсы, гранты, конференции) Апрель... Центрально-черноземный региональный информационный центр по научно-технологическому сотрудничеству с ес |
