Российская академия наук
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт БИООРГАНИЧЕСкой химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
УДК 577.21;579.23''315
ВГК ОКП
№ госрегистрации 01201365240
Инв. №
|
|
УТВЕРЖДАЮ
Директор
академик
______________ В.Т. ИВАНОВ
«28» июня 2013 г.
|
ОТЧЕТ
о научно-исследовательской работе
Разработка методов выявления эпигенетической инактивации гена супрессора PDLIM4/RIL для применения в диагностике рака молочной железы и выбора оптимальных схем индивидуальной противораковой терапии
по теме:
Выбор направления исследований.
Теоретические и экспериментальные исследования поставленных перед НИР задач.
(промежуточный)
Этап первый
№ 2013-1.2-14.512.11.0040
Государственный контракт от «03» апреля 2013 г. № 14.512.11.0040
в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям
развития научно-технического комплекса России на 2007-2013 годы»
Научный руководитель,
кандилат биологических наук,
Е.И. Фролова
подпись, дата
Москва 2013 г
Список исполнителей
Научный руководитель:
ведущий научный сотрудник, к.б.н
|
подпись, дата
|
Фролова Е.И. (раздел(ы) 1-6)
|
Исполнители темы:
|
|
|
Научный сотрудник, к.б.н.
|
подпись, дата
|
Чумаков С.П,
(раздел(ы) 3, 4, 5, сп. лит.)
|
Научный сотрудник, к.б.н.
|
подпись, дата
|
Кравченко Ю.Е.
(раздел(ы) введ.,1, 2, 6, заключ.)
|
Научный сотрудник, к.б.н.
|
подпись, дата
|
Кочетков Д.В.
(раздел 1)
|
Аспирант
|
подпись, дата
|
Лежнин Ю.Н.
(раздел 1)
|
Аспирант
|
подпись, дата
|
Ратникова Н.М.
(раздел 1)
|
Аспирант
|
подпись, дата
|
Далина А.А.
(раздел 1)
|
Аспирант
|
подпись, дата
|
Панасенко Е.Н.
(раздел 1)
|
Старший лаборант
|
подпись, дата
|
Кузьмина О.Н.
(раздел 1, сп. лит )
|
Старший лаборант
|
подпись, дата
|
Алибаева Р.А.
(раздел 1, сп. лит)
|
Нормоконтролер
|
подпись, дата
|
<Фамилия И.О.>
|
Соисполнители:
|
|
|
зав. лаб., д.б.н., профессор
|
подпись, дата
|
Чумаков П.М.
(раздел(ы) 1,4,5)
ИМБ РАН
|
зав. лаб., д.б.н., профессор
|
подпись, дата
|
Прасолов В.С.
(раздел(ы) 1) ИМБ РАН)
|
Реферат
Отчет с.82, ч.6 , рис.15, табл.3, источников 100, прил 0.
Ключевые слова: РАК МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ОПУХОЛЕВЫЕ МАРКЕРЫ, ОПУХОЛЕВЫЙ СУПРЕССОР, ГЕН PDLIM4/RIL, ТРАНСКРИПТОМА, ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, ТРАНСФОРМАЦИЯ, ПРОЛИФЕРАЦИЯ КЛЕТОК, ЦИТОСКЕЛЕТ, ИНВАЗИВНОСТЬ
Целью работы является выявление молекулярных и биологических характеристик субтипа рака молочной железы, зависящих от эпигенетической супрессии гена PDLIM4/RIL и разработка теста основанного на технологии NGS для выявления нового биомаркера рака молочной железы, связанного с подавлением гена PDLIM4/RIL. В результате проводимого исследования должна быть проведена оценка возможности использования супрессии гена PDLIM4/RIL в качестве нового маркера рака молочной железы, характеризующего субтип опухоли и возможно отличающийся по чувствительности к определенным терапевтическим походам.
В процессе выполнения данного этапа работы был разработан общий план исследований, направленных на изучение корреляции супрессии гена PDLIM4/RIL с морфологическим типом рака молочной железы, характером экспрессии генов и вовлеченности активации рецепторных киназ. Обоснованы и выбраны основные направления, методы, способы решения поставленных задач. Проведена сравнительная оценка вариантов возможных решений исследуемой проблемы с учетом результатов прогнозных исследований, проводившихся по аналогичной тематике. Теоретически обоснован выбор нового гена супрессора PDLIM4/RIL в качестве предполагаемого маркера субтипа рака молочной железы. Используя панель линий клеток рака молочной железы человека проведено определение эпигенетического состояния гена PDLIM4/RIL путем ПЦР в реальном времени, проведен анализ метилирования ДНК и гистонов. На этой же панели определена активность рецепторных и нерецепторных тирозиновых киназ. Проведено секвенирование ДНК генома линий клеток рака молочной железы с целью выявления мутаций гена PDLIM4/RIL. С помощью технологии NGS получены данные по эпигенетическому статусу гена PDLIM4/RIL и статусу транскриптома образцов линий клеток рака молочной железы. Проведен патентный поиск с целью определения перспективности и патентоспособности нового маркера рака молочной железы, основанного на эпигенетической супресси гена PDLIM4/RIL.
Содержание
Обозначения и сокращения …………………………………………………………………6
1.1.1 Анализ публикаций 16
Адапторные белки содержащие LIM и PDZ домены 16
Особенности LIM-доменов 16
Характеристика PDZ-доменов 18
Ген TRIP6 21
Ген PDLIM4/RIL 21
RIL – представитель семейства белков ALP/Enigma 22
Происхождение и эволюционная консервативность семейства ALP/Enigma 23
Геномная организация гена PDLIM4/RIL человека 24
Альтернативные транскрипты гена PDLIM4/RIL человека 25
Эволюционная консервативность PDLIM4/RIL 28
Анализ экспрессии PDLIM4/RIL и других членов семейства ALP/Enigma в различных тканях 28
Репертуар взаимодействий белка RIL 30
RIL взаимодействует с протеинтирозинфосфатазой PTP-BL 31
Краткая функциональная характеристика PTP-Bas/PTP-BL 32
RIL взаимодействует с LIM-доменным белком TRIP6 33
Роль RIL в поддержании структуры актиновых стресс-фибрилл 33
Краткая характеристика α-актининов 35
Транспортная функция RIL 36
Возможное участие RIL в злокачественной трансформации 37
Данные о дифференциальной экспрессии RIL, полученные с использованием микропанелей олигонуклеотидов 38
1.1.2. Выбор оптимального направления исследований 39
1.2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 41
Использованные реактивы 41
Культивирование клеток и ростовая среда 42
Происхождение 42
Протокол пересева культур клеток. 43
Криоконсервация и размораживание клеточных линий. 44
Полимеразная цепная реакция. 44
Синтез комплементарных ДНК 45
Определение нуклеотидных последовательностей кДНК 45
Биоинформатическая обработка данных секвенирования 46
Вестерн-блот анализ белков. 46
Оценка скорости клеточного деления 47
Определение скорости миграции клеток 47
Аналитическое выделение плазмидных ДНК из трансформированных компетентных клеток 51
Выделение и анализ мРНК, связанной полисомами 53
2.1 АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ мРНК RIL В ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА 54
Список использованных источников 69
Обозначения и сокращения
В настоящем отчете о НИР применяют следующие Обозначения и сокращения:
LTR- длинные концевые повторы
MuLV - вирус лейкоза мышей
cPPT - центральный пурин-пиримидиновый тракт
WPRE - геном вируса гепатита сурка
кДНК - комплементарная ДНК
п.н. - пара нуклеотидов
ФС - фетальная сыворотка
ФС-КРС - фетальная сыворотка крупного рогатого скота
а.о. - аминокислотный остаток
БСА - бычий сывороточный альбумин
ВИЧ - вирус иммудефицита человека
ВПЧ-18 - вирус папилломы человека 18 серотипа
ДКП - длинный концевой повтор
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДТТ - дитиотрейтол
н. – нуклеотид
мРНК - матричная РНК
Трис - трисгидроксиметиламинометан
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭФ - электрофорез
п.н. - пара нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЭГ - полиэтиленгликоль
РНК - рибонуклеиновая кислота
СЯЭ – сигнал ядерного экспорта
ФСБ – фосфатно-солевой буфер
ЭГТА – этиленгликольтетрауксусная кислота
ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭМТ – эпителиально-мезенхимальная трансформация
ЭТС – эмбриональная телячья сыворотка
AF (AlexaFluor) – общее название флюоресцентных красителей, разработанных компанией Molecular Probes
ALP (α-actinin associated LIM domain protein) – α-актинин-ассоциированный LIM-доменный белок
APC (от adematous poliposis coli) – ген-опухолевый супрессор, мутации которого идентифицированы при семейном аденоматозном полипозе и спорадических опухолях ободочной кишки
CEF (от chicken embryonic fibroblasts) – куриные эмбриональные фибробласты
CLP-36 (от carboxyl-terminal LIM domain protein of 36 kDa) – карбокси-терминальный LIM-доменный белок массой 36 кДа
CytB (Cytochalasin B) – цитохалазин Б
DMЕМ (Dulbecco's Modified Eagle Medium) – ростовая среда Игла, модифицированная Дульбекко
DMSO (dimethyl sulfoxide) – диметил сульфоксид
EGFR (от epidermal growth factor receptor) – рецептор эпидермального фактора роста
ENH (от Enigma homologue) – белок, гомологичный белку Enigma
ERK (от extracellular signal-regulated kinase) – киназа, регулируемая внеклеточными сигналами, дерегуляция этого сигнального каскада часто встречается в канцерогенезе
FACS (fluorescense-activated cell sorting) – метод проточно-цитометрической селекции клеток, основанной на их флуоресценции
FITC (fluorescein isothiocyanate) – флуоресцеин изотиоцианат, зеленый флуоресцентный краситель
GFP (green fluorescent protein) – зеленый флуоресцентный белок
HA (от haemoagglutinin) – гемагглютинин, мотив, часто используемый для мечения экзогенно-экспрессируемых белков
HIV-1 (human immunodeficiency virus type1) – вирус иммунодефицита человека, тип 1
HMEC (human mammary epithelial cells) – клетки эпителия молочной железы человека
HRP (от horseradish peroxidase) – пероксидаза хрена
IκB (от inhibitor of κB) – ингибитор κB
JNK (от Jun N-terminal kinase) – киназа N-конца Jun
lacZ – ген β-галактозидазы
LatA (Latrunculin A) – латрункулин А
LB – среда Луриа-Бертани
LEF (от lymphoid enhancer factor) – лимфоидный энхансерный фактор, один из компонентов бета-катенин-зависимого сигнального каскада
LIM – структурный белковый домен, названный по первым буквам генов lin-11, isl-1 и mec-3, кодирующих белки, у которых он был впервые описан
LTR (long terminal repeat) – длинный концевой повтор
mCMV (minimal promotor of cytomegalovirus early gene) – минимальный промотор раннего гена цитомегаловируса
MEGM (от mammary epithelium growth medium) – специализированная ростовая среда для культуры первичных эпителиоцитов молочной железы
MES – 2-(N-Морфолино)этансульфоновая кислота
M-MLV (от Moloney murine leukemia virus) – вирус Молони лейкоза мышей
NA (от numerical aperture) – числовая апертура объектива, характеристика, определяющая разрешающую способность линзы
NFκB – ядерный фактор каппа Б (от nuclear factor κB)
ONPG - o-нитрофенил-β-D-галактопиранозид
PDLIM (от PDZ and LIM protein)
PDZ – структурный белковый домен, названный по первым буквам белков PSD95, DlgA и ZO-1, у которых он был впервые описан
PIPES – пиперазин-N,N’-бис(2-этан)сульфоновая кислота
PTP (от protein tyrosine phosphatase) – тирозиновая фосфатаза
RE (response element) – чувствительный элемент
RIL (reversion induced LIM gene/protein)
RISC (от RNA-induced silencing complex) – РНК-индуцированный комплекс, осуществляющий сайленсинг
SDS – додецилсульфат натрия
shРНК – короткая шпилечная РНК, используемая для РНК-интерференции (от англ. short hairpin)
SIN (от self-inactivating) – самоинактивирующийся ДКП, необходимый для получения ретровирусов, неспособных к репликации
siРНК– короткая интерферирующая РНК (от англ. short interfering)
TCF (от T-cell factor) – фактор Т клеток, транскрипционный фактор, компонент бета-катенин-зависимого сигнального каскада, гиперактивация которого часто встречается в канцерогенезе
TGFβ – трансформирующий фактор роста β (от англ. transforming growth factor β)
THRβ – рецептор тиреоидного гормона бета (от англ. thyroid hormone receptor)
TRIP6 (thyroid hormone receptor interacting protein 6)
VSV-G (от vescular stomatitit virus G protein) – оболочечный белок G вируса везикулярного стоматита, часто используется для псевдотипирования рекомбинантных вирусных частиц
WPRE (от woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element) – посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка, повышает стабильность вирусных транскриптов
X-gal – 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид
ZASP (от Z-band alternatively spliced PDZ-motif protein) – альтернативно сплайсированный PDZ-белок Z-диска
ВВЕДЕНИЕ
Злокачественные заболевания возникают при утрате клеткой контроля за стабильностью генома, в результате чего она вступает на путь эволюции в сторону приобретения автономии делений, и последовательной селекции все более быстро делящихся вариантов, характеризующихся потерей специфических функций и ускоряющейся экспансией. В процессе канцерогенеза клетка последовательно накапливает множество генетических и эпигенетических повреждений, которые обеспечивают ускорение пролиферации и экспансию. Несмотря на существование морфологической классификации различных форм злокачественных заболеваний, набор поврежденных генов и последовательность приобретения мутаций чрезвычайно разнообразны, так как проходят по множеству сценариев. Наряду с индивидуальными генетическими различиями между людьми, вариации в процессе канцерогенеза обуславливают высокую степень разнообразия, как течения заболевания, так и ответ на применяемую терапию. В связи с этим, медицина будущего, безусловно, должна учитывать генетические особенности опухоли конкретного пациента при выборе наиболее эффективного способа лечения. С этой целью в настоящее время ведется поиск молекулярных маркеров, характеризующих отдельные формы рака, и изучение корреляции выявленных маркеров с характером опухоли, течением опухолевого процесса и особенностей реакции на применяемую терапию опухолей, имеющих данный маркер. Планируемая работа предполагает изучение в качестве перспективного маркера опухолей молочной железы гена супрессора PDLIM4/RIL.
Целью планируемых работ является разработка подхода к дифференциальной диагностике молекулярных разновидностей рака молочной железы для оптимизации персонифицированной терапии. Помимо морфологических типов рака молочной железы большое значение для прогноза и выбора оптимальной терапевтической стратегии имеют молекулярные маркеры, свидетельствующие о нарушениях в тех или иных молекулярных процессах клетки. Исследования, проведенные в лаборатории, указывают на возможность использования в качестве ценного молекулярного маркера эпигенетический статус гена-супрессора PDLIM4/RIL. Этот ген был впервые картирован в нашей лаборатории на участке длинного плеча хромосомы 5 (5q31), часто делетируемой при ряде злокачественных заболеваний человека. Помимо делеций, ген PDLIM4/RIL часто подвергается эпигенетической супрессии, в результате которой его экспрессия подавляется. Подавление экспрессии RIL происходит только в части случаев рака молочной железы и по имеющимся в лаборатории данным в таких случаях отмечается меньшая степень морфологической трансформации и пониженная частота активации тирозиновых киназ. Конкретной целью данной работы является сравнительная характеристика образцов рака молочной железы в которых отмечается подавление экспрессии гена PDLIM4/RIL с образцами, экспрессирующими нормальные уровни этого гена супрессора. Согласно высказанной нами ранее гипотезе, возникновение эпигенетической супрессии гена RIL направляет клетки по особому типу трансформации, который может не вовлекать изменения активности рецепторных киназ, функция которых тесно связана с активацией Src, поскольку утрата активности гена RIL сама по себе приводит к конститутивной активации Src киназы. Если эта гипотеза будет подтверждена в результате проводимой работы, то эпигенетическую супрессию гена PDLIM4/RIL можно будет рассматривать в качестве маркера, характеризующего определенный субтип рака молочной железы. Будущие исследования прольют свет на возможность использования нового маркера для выбора оптимальных стратегий терапии, а также определения прогноза течения заболевания.
Оценка современного состояния решаемой научно-технической проблемы
Ген RIL (reversion-induced LIM-domain containing) в последствии получивший современное название PDLIM4, был впервые идентифицирован при изучении трансформации фибробластов под действием онкогена H-Ras. Экспрессия гена RIL супрессируется при трансформации, однако восстанавливается в фенотипических ревертантах, что навело на мысль о функционировании гена RIL в качестве опухолевого супрессора [1]. В нашей лаборатории этот ген был картирован в области 5q31 генома человека, которая часто делетирует при злокачественных заболеваниях [2], что хорошо согласуется с возможной супрессорной ролью этого гена у человека.
Ген RIL кодирует адаптерный белок, содержащий два типа доменов, часто встречающихся в белках, принимающих участие в белок-белковых взаимодействиях – С-концевой LIM-домен и N-концевой PDZ домен. Этот ген относится к семейству генов ALP/Enigma которые обнаруживаются в ассоциации с актиновым цитоскелетом [2, 3]. Это консервативные белки, которые у нематоды C. elegans представлены единичным геном (alp-1/eat-1) [4-7]. Белок RIL, как и другие представители этого семейства, связан с актиновым цитоскелетом через α-актинины [8, 9]. Белки этого семейства важны для поддержания структуры Z-дисков миофибрилл благодаря их роли в стабилизации актиновых филаментов [5, 10, 11]. Нарушения некоторых из этих генов сопровождаются миопатиями у животных и человека [11-18]. В немышечных клетках белки семейства PDLIM играют похожую роль в стабилизации актиновых стресс-фибрилл. В частности, RIL увеличивает сродство α-актинина к филаментозному актину (F-актину), что сопровождается выраженной перестройкой актинового цитоскелета [3]. В нашей лаборатории обнаружено несколько альтернативно сплайсированных изоформ – продуктов гена RIL, одна из которых играет роль доминантно-негативного регулятора полноразмерного белка RIL и участвует в перестройке цитоскелета в ответ на определенные стрессы [19].
Недавно установлена еще одна важная функция гена PDLIM4/RIL, которая непосредственно объясняет его роль в качестве опухолевого супрессора. Было установлено, что RIL участвует в регуляции киназной активности протоонкогена Src. RIL, действуя в качестве адаптера связывается с активированным (фосфорилированным) белком Src и одновременно с протеинфосфатазой PTPL1 (или PTP-BL), в результате чего фосфатаза осуществляет дефосфорилирование и инактивацию протеинкиназной активности белка Src [20]. Таким образом RIL снижает активность Src после его активации, способствуя обратимости пролиферативного сигнала. Поэтому понятно, что утрата активности RIL может сопровождаться конститутивной активацией киназы Src, в то время как увеличение экспрессии белка RIL, напротив, будет способствовать снижению активности Src, характерной для состояния фенотипической реверсии.
Работами ряда авторов было установлено, что в ряде злокачественных заболеваний человека определенный процент опухолей демонстрирует эпигенетическую супрессию транскрипции гена PDLIM4/RIL [21-24]. Наиболее часто супрессия RIL наблюдается в опухолях простаты, толстого кишечника, молочной железы и острой миелоидной лейкемии. При этих заболеваниях метилирование и супрессия гена RIL наблюдается приблизительно в половине случаев. Очевидно, подавление экспрессии гена RIL играет важную роль в канцерогенезе, поскольку восстановление экспрессии сопровождается остановкой пролиферации [23].
Основание и исходные данные для разработки темы.
В нашей лаборатории при исследовании панели линий клеток рака молочной железы было обнаружено, что приблизительно в половине линий экспрессия гена RIL подавлена на уровне транскрипции. При этом было обнаружено, что в другой половине линий уровень экспрессии RIL соответствует контрольным нормальным клеткам молочной железы. Характерно, что два типа линий клеток также отличались по морфологическим признакам. Линии с нормальным уровнем экспрессии гена RIL обладали выраженными признаками морфологической трансформации, утратой эпителиальной морфологии, характерной эпителиально-мезенхимальной трансформации, выраженной дезогранизацией актинового цитоскелета, увеличением подвижности клеток и снижением адгезии. Характерно, что подавление экспрессии RIL в этих линиях с помощью РНК-интерференции не сопровождалось реверсией трансформированного фенотипа, в то время как восстановление экспрессии RIL в клетках демонстрирующих его супрессию приводило к снижению трансформированного фенотипа. Полученные данные указывают на существование двух типов линий клеток рака молочной железы, коррелирующих с уровнем экспрессии RIL. Согласно рабочей гипотезе, подтверждающейся рядом наших неопубликованных данных, фенотипические различия обусловлены отличиями в механизме активации тирозиновых киназ. Если в линиях, утративших в результате эпигенетическогй супрессии транскрипцию гена RIL активация Src достигается путем отсутствия контроля со стороны фосфатазы PTP-BL, то в линиях, где экспрессия RIL не изменена, трансформация поддерживается за счет иных событий, включающих активацию Src-подобных киназ за счет альтернативных механизмов. Один из таких механизмов может осуществляться путем активации EGFR, другой – путем активации HER2. В этом случае, применение терапии, направленной на подавление HER2 (herceptin) оказаться неэффективным в случае опухолей, реализующих сценарий трансформации за счет подавления экспрессии RIL.
Планируемая работа предполагает проведение расширенного исследования корреляции супрессии гена RIL с менее выраженной фенотипической трансформацией, а также частоты вовлечения активации EGFR и HER2 в зависимости от эпигенетического статуса гена PDLIM4/RIL. Эта работа будет проведена на большой панели линий клеток рака молочной железы, имеющейся в нашей коллекции, а ее результаты будут верифицированы на клинических образцах рака молочной железы. Эта работа оценит значение гена RIL в качестве дифференциального маркера приблизительно половины случаев рака молочной железы, что будет способствовать осознанному выбору оптимальных схем терапии.
Связь данной работы с другими научно-исследовательскими работами.
Коллектив лаборатории на протяжении последних многих лет занимался картированием области хромосомы 5, в которой располагается кластер цитокиновых генов (5q31). Эта же область часто повреждается при злокачественных заболеваниях, что указывает на росположение в ней опухолевого супрессора. Коллектив лаборатории вел поиск этого гена и одним из кандидатов на такой ген являлся ген PDLIM4/RIL. В лаборат ории было проведено функциональное изучение этого гена, показано, что он экспрессируется в виде нескольких альтернативных продуктов, изучены свойства различных изоформ. В лаборатории были также обнаружены свойства гена PDLIM4/RIL вляить на состояние актиновго цитоскелета. Данная разработка логически следует из многолетних исследований лаборатории.
Цели и задачи первого этапа исследований, их место в выполнении НИР в целом
На данном первом этапе исследования основные задачи включали изучение литературных источников по проблеме адапторных белков семейства, содержащих PDZ и LIM домены, роли гена PDLIM4/RIL и злокачественной трансформации клеток. На основании литературных источников предполагалось разработать оптимальный план исследований, направленных на установление корреляции утраты экспрессии гена PDLIM4/RIL и приобретением характерных изменений экспрессии генов, выявляемые путем секвенирования транскриптома по технологии NGS. Предполагалось также проведение патентных исследований с целью установления потенциальной перспективности супрессии гена RIL в качестве молекулярного маркера субтипа рака молочной железы. В плане экспериментальной работы предполагалась отработка подходов с использованием ранее охарактеризованных линий рака молочной железы человека, а именно, определение эпигенетического статуса гена PDLIM4/RIL на панели линий клеток рака молочной железы путем ПЦР в реальном времени, анализ метилирования ДНК и гистонов, определение активности рецепторных и нерецепторных тирозиновых киназ, состояния сигнальных путей, проведение секвенирования генома линий клеток рака молочной железы с целью выявления мутаций гена PDLIM4/RIL, получение данных по эпигенетическому статусу гена PDLIM4/RIL и статусу транскриптома образцов линий клеток рака молочной железы с помощью технологии NGS. Задачи, намеченные к выполнению на первом этапе работы выполнены в полном объеме.
Обоснование необходимости проведения НИР.
Необходимость проведения НИР диктуется задачами по переходу медицины на персонифицированный подход к лечению заболеваний. Существование нескольких типов рака молочной железы обуславливает их различную чувствительность к терапевтическим воздействиям. Наблюдения лаборатории указывают на корреляцию супрессии гена PDLIM4/RIL и отсутствия нарушений регуляции рецепторных тирозиновых киназ, что указывает на существование отдельного субтипа рака молочной железы. Этот субтип может обладать особенностями в чувствительности к терапии. Для его быстрой идентификации требуется разработка диагностического теста, позволяющего определять супрессию гена PDLIM4/RIL.
Сведения о планируемом научно-техническом уровне разработки.
Ген PDLIM4/RIL является объектом исследований лаборатории на протяжении более двадцати лет и мы являемся авторами исходных работ по его изучению. Принадлежность гена к опухолевым супрессорам была также впервые постулирована нами, и недавно это предположение нашло экспериментальное подтверждение. В нашей лабораториивперрвые была замечена корреляция супрессии гена PDLIM4/RIL с морфологией и биохимическими свойствами опухолевых клеток. Поэтому, планируемое исследование будет проведено на самом высоком научном уровне, а получаемые результаты будут носить приоритетный характер.
Планируемая разработка базируется на многолетних работах коллектива, которые имели приоритетное значение для установления роли опухолевого супрессора PDLIM4/RIL в злокачественной трансформации. Наблюдения, проведенные в лаборатории свидетельствуют о существенном потенциале гена RIL в качестве биомаркера распространенного (около 50%) подтипа рака молочной железы. Быстрая диагностика этого подтипа путем измерения уровня транскриптов гена RIL будет способствовать адекватному выбору терапии. В связи с значительным разнообразием течения заболевания у пациентов медицина будущего будет ориентироваться на персонифицированные подходы к терапии. В этом смысле планируемая разработка актуальны, поскольку она направлена на выявление распространенного подтипа рака молочной железы, требующего персонифицированного подхода к лечению.
Сведения о патентных исследованиях и выводы из них.
При выполнении первого этапа НИР были проведены патентные исследования по теме «Разработка методов выявления эпигенетической инактивации гена супрессора PDLIM4/RIL для применения в диагностике рака молочной железы и выбора оптимальных схем индивидуальной противораковой терапии» по результатам которых был сделан вывод о том, что объект исследования может подлежать охране патентами.
ГЛАВА 1
Аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках НИР.
1.1. АНАЛИЗ ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ И ВЫБОР ОПТИМАЛЬНОГО НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ
|
