;579. 23''315 вгк окп
Скачать 0.89 Mb.
|
Протокол пересева культур клеток.1. Приготовить смесь растворов DMEM и сыворотки в отношении 9:1. Рассчитывать объём смеси исходя из способа пересева. 2. Удалить ростовую культуральную среду. 3. Промыть 2 раза по 10 мл раствором PBS. 4. Удалить PBS, остатки PBS убрать пипеткой. 5. К клеткам добавить 0,5 мл раствора трипсина, покачать для равномерного распределения по всей поверхности монослоя. При необходимости поставить клетки в термостат (37°C). 6. Когда монослой клеток разрыхлится под воздействием трипсина, добавить ростовую среду DMEM c 10% FBS (аккуратно, чтобы не возникла пена). Добавляемый объём можно определить из соображений удобства пересева. Например, если пересев идёт на 5 чашек, то можно добавить 9,5 мл. 7. Часть клеток перенести на новые чашки. 8. Добавить ростовую среду до объёма 10мл. 9. Содержимое каждой чашки дополнительно пипетировать для разрушения агрегатов клеток с целью получения гомогенной суспензии. Не бояться образования пены, которая исчезнет при дальнейшем инкубировании в термостате. Криоконсервация и размораживание клеточных линий.Для замораживания в жидком азоте (-1960С) клетки снимали с поверхности культуральных сосудов раствором трипсина с версеном (1:3), осаждали из суспензии центрифугированием при 1000 об/мин 5 мин и суспендировали в среде для заморозки, состоящей из среды DMEM с добавлением 40-80%- ФС и 10% ДМСО. Концентрацию клеток доводили до 1-2 млн клеток/мл, расфасовывали клеточную суспензию в полиэтиленовые ампулы фирмы «Nunk» по 1 мл. Ампулы помещали в пары жидкого азота (-1200С) или в холодильник (-700С) на 24 часа, после чего переносили непосредственно в жидкий азот. Размораживали клетки, помещая ампулы в теплую воду с температурой 37 - 410C, после чего отмывали клетки в среде DMEM и осаждали центрифугированием 5 мин при 1000 об/мин. Далее клетки суспендировали в ростовой среде DMEM(M) с 15% ФБС и высевали в культуральные планшеты или стеклянные сосуды. Полимеразная цепная реакция.Реакции проводили со специфическими праймерами в условиях, продиктованных составом праймеров, размером ДНК и в зависимости от типа использованной термостабильной полимеразы. ПЦР проводили с использованием амплификатора фирмы Bio-Rad (США). Для анализа продуктов ПЦР использовали метод гель-электрофореза. Электрофорез проводили в 1,5% горизонтальном агарозном геле в буфере TBE (89 mM Трис-НСl; 2 мМ ЭДТА pH 8.0; 89мМ Н3BО3). Для визуализации ДНК использовали бромистый этидий, который добавляли непосредственно в гель и в буфер в процессе их приготовления до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Оценку длины фрагментов ДНК проводили, сравнивая положения зон проб с зонами маркерной ДНК известной длины. Синтез комплементарных ДНККомплементарные ДНК синтезировали на матрице суммарной РНК с использованием синтетического «случайного» праймера dN6. Синтез проводили в 20 мкл раствора состава: 4 мкл пятикратного буфера для обратной транскриптазы (Promega, США), 10 мМ DTT, по 1 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 2,5 М гексамера dN6, 50 е.а. обратной транскриптазы Mo-MuLV (Промега, США) при 370C в течение 1 часа. Перед добавлением обратной транскриптазы смесь прогревали при 650С в течение 2 минут. Определение нуклеотидных последовательностей кДНКСеквенирование соответствующих фрагментов генома вирусов и клеток проводили на автоматическом анализаторе ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Полученные последовательности редактировали с помощью программы SeqMan II DNASTAR 7.0. Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с ранее опубликованными выполняли с использованием сервера Национального центра биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information, США) BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), включающего базы данных GenBank (NCBI, США), EMBL (European Molecular Biology Laboratory) и DDBJ (DNA DataBank of Japan) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Для выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали приложение ClustalW программы Mega 4.1. Все генно-инженерные манипуляции, микробиологические процедуры (получение и трансформация компетентных клеток E.coli, наработка и анализ рекомбинантных ДНК) проводили в соответствии с инструкциями к используемым наборам ферментов и китов. Для проведения трансфекции плазмидные ДНК были наработаны в препаративных количествах из 1000 мл среды Лурия-Бертани и выделены с использованием набора лабораторных реагентов для выделения плазмидной ДНК, очищенной от эндотоксинов «EndoFree Plasmid Maxi Kit (QIAGEN, Cat.12362). Рекомбинантные варианты лентивирусов получали методом трансфекции с использованием Lipofectin Reagent в среде Opti-MEM (Gibco BRL). Для получения вариантов гена с заданными свойствами проводили синтез перекрывающихся фрагментов гена в виде олигонуклеотидов протяженностью 45-55 пар оснований, их отжиг, последующую достройку брешей полимеразой, соединение фрагментов ДНК лигазой, амплификацию с помощью ПЦР с введением сайтов для рестриктаз. Полученные копии синтетического гена далее вводятся в ДНК-плазмиды с помощью генно-инженерных технологий. |
Похожие:
 | Вгк окп № госрегистрации Спектроскопия комбинационного рассеяния, которая позволяет изучать колебательные и вращательные состояния молекул гемопорфирина и... | | Вгк окп Ключевые слова: ускорители, ядерные реакции, структура атомных ядер, ионно-пучковые методы анализа материалов, детекторы, базы данных,... |
 | План внутришкольного контроля за учебно-воспитательным процессом Достижение соответствия функционирования и развития педагогического процесса в гбоу сош №315 требованиям государственного стандарта... | | 8, 15, 22 апреля 2011 года с 17 до 20. 30 по адресу ул. Вавилова,... Вавилова, д. 7, ауд. 315 преподаватель Ляпунова Е. Э. принмает зачет с целью получения допуска к кандидатскому экзамену по английскому... |
| Reinforced concrete piles. Specifications окп 58 1700 Дата введения... Внесены всесоюзным ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательским институтом гидротехники имени Б. Е. Веденеева | | Заседание молодежной организации «Мы вместе» Поддубская Екатерина Сергеевна, главный специалист спб гку «СПб дн», тел.: (812) 579-42-16 |
| Министерство здравоохранения СССР приказ от 21 июля 1988 года n 579... Тема №6 Роль и место тыловых госпиталей в современной системе лечебно-эвакуационных мероприятий | | Институт дополнительного профессионального образования центр переподготовки... Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 18, комн. 206, телефон/факс (812) 315-06-47 |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Литература 6в: «Тарас Бульба» дочитать, ответить на вопросы после текста, с. 314-315 | | • 176 км трасс (54 синих) (50 км), 105 красные (99 км), 17 черные (26 км) Вероны, 330 км от аэропорта Венеции, 315 км от аэропорта Милана, 110 км от аэропорта Инсбрук |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Проектная наполняемость 22 класса/комплекта, школа рассчитана на 450 человек в одну смену, в настоящее время обучается 579 учащихся,... | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Рабочая образовательная программа по русскому языку для 5 «Б» класса гбоу сош №315 составлена в соответствии с |
| 8-4 Давыдова М. Ю. Алгебра Макарычев: 444,445,484,486,485,526,550,549,551,572-579... Образовательные: способствовать обобщению и закреплению понятий о металлах главных и побочных подгрупп и их соединениях | | Рабочая программа По дисциплине «Общая и медицинская генетика» Для... По Государственному образовательному стандарту высшего профессионального образования 315 часов |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Краткая информация о педагогической части практики на 4 курсе (подробно см в программе педагогической практики, представленной в... | | Формирование и развитие рынка бытового обслуживания населения ( на примере Хабаровского края ) Защита состоится «17» мая 2012 года в 16-00 часов на заседании диссертационного совета д 212. 294. 03 при фгбоу впо «Тихоокеанский... |
