Биоинформатическая обработка данных секвенирования
Филогенетический анализ: Нуклеотидные последовательности для проведения филогенетического анализа были получены из базы данных GenBank. Обработка последовательностей, филогенетический и молекулярно-генетический анализ проводились с использованием программных пакетов MEGA 4 [26] и Vector NTI 9 (InforMax, США).
Генетические расстояния между последовательностями рассчитывали при помощи программы Mega v.4.1 с использованием двухпараметрической модели нуклеотидных замещений Кимуры [27].
Вычисление генетической дивергенции (π) между штаммами вариантов вируса Сендай и другими представителями семейства парамиксовирусов проводили, используя программу DNAsp v. 4.10.9 [28] в соответствии с рекомендациями Нея и Миллера [29] в окне длиной 100 нуклеотидов, с шагом 25 нуклеотидов.
Анализ рекомбинации проводили, используя малый информационный критерий Akaike [30] в программе GARD (Genetic Algorithms for Recombination Detection) [31].
Праймеры. Праймеры, использованные в работе, были рассчитаны в программе Oligo 6.0.
Вестерн-блот анализ белков.
Для детекции белков экстракты клеток фракционировали в полиакриламидном геле, переносили белки на мембраны и инкубировали с специфическими антителами. Проявка белков осуществлялась обработкой вторичными антителами, мечеными ферментами и добавлением их субстратов.
Более подробно, методика выглядит следующим образом.
1. Электрофоретическое разделение белков проводили в камере “BioRad” в 5% концентрирующем и 14% разделяющем акриламидном геле при V=100 через концентрирующий и разделяющий гель.
2. Перенос белков с геля на мембрану осуществлялся в Mini Trans-Blot cell “BioRad”, на мембрану Immun-BlotTMPVDF Membrane for Protein Blotting, 0,2µm при V = 100 1 час 20 минут.
3. После легкого промывания буфером для переноса мембраны поместили в блокирующий раствор - ТВS рН 7,4 с 5% молоком (Skim Milk Powder, Biochemika, Fluka) на 1 час при RT на качалке.
4. Отмывали мембраны 3 раза по 5 минут ТВS рН 7,4 на качалке.
5. В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела или поликлональные специфические сыворотки (Abcam. США), в рабочей концентрации 0,2 мкг/мл, в ТВS рН 7,4 с 0,1% Tween-20 и 5% молока. Инкубировали мембраны с антителами в течение ночи, ~ 16 часов, при +4ºС.
6. После связывания с первичными антителами отмывали 3 раза по 5 минут ТВS рН 7,4 с 0,1% Tween-20 на качалке.
7. В качестве вторичных антител использовали Anti-rabbit IgG (Whole molecule) alcaline phosphatase conjugate (Sigma) в рабочем разведении 1:5000 в ТВS рН 7,4 с 0,1% Tween-20 и 5% молока. Инкубировали 1 час при RT на качалке.
8. После связывания с конъюгатом отмывали 3 раза по 5 минут ТВS рН 7,4 с 0,1% Tween-20 на качалке и 1 раз с буфером для субстрата (АР – буфер: 100 mM Tris, 100mM NaCl, pH 9,5 с добавлением 50 mM MgCl2).
9. В качестве субстрата использовали BCIP (5-bromo-4-chloro- 3-indolyl phosphate) и NBT (Nitro Blue tetrazolium). Останавливали реакцию промыванием в дистиллированной воде.
Оценка скорости клеточного деления
Клетки высевали на 12-луночные планшеты по 1.5×104 клеток на лунку в двух или трех повторах в полной ростовой среде. Каждые 24 ч. клетки снимали трипсином и их количество дважды считали в камере Горяева.
Определение скорости миграции клеток
На монослой клеток пластиковыми носиками для микропипетки наносили прямолинейные «раны». Зарастание «раны» за счет миграции в нее клеток фотографировали через определенные промежутки времени.
Оценка подвижности клеток с помощью трансмиграционных камер
Перед началом эксперимента клетки инкубировали в бессывороточной среде в течение 4 ч., затем клетки трипсинизировали, дважды отмывали от трипсина в бессывороточной среде или фосфатно-солевом буфере и считали в камере Горяева. Клетки помещали в бессывороточной среде с добавлением 0.1% БСА в верхнюю камеру трасмиграционных вставок в 24-луночном планшете по 1×105 клеток на лунку. Нижнюю камеру заполняли ростовой средой с добавлением 5% ЭТС для стимуляции хемотактической миграции клеток. Через 1-8 ч оставшиеся клетки из верхней камеры удаляли ватным тампоном, а клетки на нижней поверхности трансмиграционной вставки фиксировали метанолом и окрашивали метиленовым синим. Для количественной оценки миграции проводили обсчет клеток на нижней поверхности мембраны в пяти случайных полях зрения при световой микроскопии. Альтернативно, клетки, окрашенные метиленовым синим, лизировали в 0.1% SDS в фосфатно-солевом буфере и измеряли оптическую плотность полученного раствора при 600 нм (OD600).
Использовались трансмиграционные вставки с пористой мембраной (BD Biosciences), размер поры – 8 мкм. Время миграции клеток определяли эмпирически для каждой клеточной линии.
Измерение клеточной адгезии
Перед началом эксперимента клетки инкубировали в бессывороточной среде в течение 4 ч., затем клетки трипсинизировали, дважды отмывали от трипсина в бессывороточной среде или фосфатно-солевом буфере, считали в камере Горяева, а затем при необходимости окрашивали витальным флюоресцентным красителем Calcein AM (Invitrogen) в соответствии с рекомендациями производителя. Равные количества клеток высевали в трех повторах в бессывороточной среде с добавлением 0.1% БСА в лунки планшетов, дно которых было заранее покрыто различными лигандами (фибронектином, фибриногеном). Клеткам давали прикрепиться в течение 30-120 мин., процесс адгезии клеток контролировали визуально под микроскопом. Неприкрепившиеся клетки дважды аккуратно отмывали теплым фосфатно-солевым буфером. Качественно адгезию оценивали визуально при световой микроскопии, а количественно – измеряя флюоресценцию кальцеина в зеленом спектре (использовали настройки для FITC). Оптимальное время прикрепления для каждой клеточной линии определяли эмпирически. На лунку 96-луночной плашки высевали по 5×104 клеток.
Для адгезионных тестов культуральные сосуды сначала обрабатывали растворами лигандов (фибронектин в концетрации 5мкг/мл, фибриноген в концетрации 2мкг/мл) в течение 1 ч. при 37ºС, аккуратно промывали фосфатно-солевым буфером, а затем для предотвращения неспецифического связывания блокировали 2% БСА на фосфатно-солевом буфере в тех же условиях, избыток БСА удаляли двукратной отмывкой фосфатно-солевым буфером. В качестве контроля использовали непокрытый культуральный пластик.
Колониеобразование в полужидкой среде
Для предотвращения прикрепления клеток к культуральному пластику сначала заливали базальный 0.5% агар на полной среде. Клетки трипсинизировали, дважды отмывали от трипсина и считали в камере Горяева. Равные количества клеток перемешивали с 0.7% легкоплавкой агарозой или 1.2% метилцеллюлозой, приготовленных на полной ростовой среде, и наслаивали на базальный агар. Клетки культивировали 3-14 дней до образования колоний, которые затем считали. На лунку 6-луночного планшета высевали по 5×104-2×105 клеток.
Метод проточной цитометрии
В данном проекте этим методом определяли токсичность рекомбинантных онколитических белков. Клетки метили введением плазмиды, экспрессирующей флуоресцентный белок (EGFP), что позволило с помощью лазерного флуоресцентного цитофлуориметра отделить флуоресцентную фракцию от добавленных в смесь немеченых клеток. Мечеными являются опухолевые клетки, немечеными – нормальные. После обработки потенциально токсическим препаратом проводили определение изменения соотношения фракций меченых и немеченых клеток.
Метод детекции апоптоза с применением Аннексина V.
При индукции апоптоза происходит модификация мембран, которую способен детектировать препарат Annexin V. Детекцию проводили с помощью проточного цитофлуориметра Facs-Advantage GE, который является препаративным цитофлуориметром высокого класса. Он оснащен тремя лазерами, что позволяет одновременно отслеживать несколько параметров клеток.
Определение токсичности с помощью ХТТ теста
Для определения токсичности онколитических препаратов использовали ХТТ тест. Метаболизирующие живые клетки активно превращают бесцветный формазановый предшественник ХТТ в цветное соединение, интенсивность которого можно детектировать с помощью планшетного ридера. При действии цитотоксических препаратов клетки утрачивают способность метаболизировать ХТТ, что приводит к ослаблению окраски.
Технология лентивирусного переноса
Наиболее удобным методом введения экспрессирующих генетических конструкций является лентивирусный перенос. Лентивирусный вектор создавали на основе вируса иммунодефицита человека, из которого удалены все последовательности, кодирующие белки, но сохранены регуляторные последовательности. В вектор вводили требуемые рекомбинантные гены, после чего с использованием упаковочных линий (НЕК293Т) получали вирусные частицы одноразового действия. Заражая подобными частицами клетки, удается ввести генетический материал, который встраивается строго упорядоченным способом без нарушения структуры генетической конструкции. Ряд лентивирусных векторов содержал вторую кассету, экспрессирующую ген устойчивости к антибиотику, по которому можно было проводить селекцию клеток, получивших эту генетическую конструкцию.
Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле, выделение из геля
Для разделения фрагментов ДНК использовали агарозу компании фирмы Хеликон (Россия). Электрофорез проводили в трис-ацетатном буфере (40 мМ трис-ацетат, pH 7.5; 2 мМ ЭДТА) с добавлением в него бромистого этидия до конечной концентрации 10 мкг/мл. Полосы ДНК на геле визуализировали с помощью трансиллюминатора, соединенного с цифровой фотокамерой Kodak.
Фрагменты ДНК выделяли из агарозного геля с помощью набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) согласно указаниям производителя.
Обработка фрагментов ДНК эндонуклеазами рестрикции
Обработка целевых фрагментов ДНК эндонуклеазами рестрикции проводилась согласно протоколу, рекомендованному производителем (New England Biolabs). По окончании реакции ДНК фракционировали в агарозном геле. В случае рестрикции амплифицированных фрагментов, рестрикционную смесь чистили на колонках набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
Лигирование фрагментов ДНК в плазмидные векторы
Для лигирования фрагментов ДНК, представляющих каждый из генов вируса Сендай в лентивирусный вектор pLCMV-FLAG-puro выдерживали молярные соотношение вектор/вставка 1:6. В качестве контроля проводили лигирование вектора без вставки. Для реакции использовали лигазу New England Biolabs в буфере производителя. Реакция проходила в течение 12 часов при 14оС.
Трансформация клеток E. coli JM109
К 100 мкл компетентных клеток JM109, размороженных на льду, добавляли плазмидную ДНК (до 10 нг) и инкубировали во льду в течение 30 мин. Далее делали тепловой шок (30 сек инкубировали при 42оС, затем переносили в лёд на 5-10 мин), добавляли 1 мл среды LB, инкубировали клетки 1 час при 37оС.
Селекцию трансформантов проводили на чашках Петри (1.5% LB агар), содержащих 100мг/мл ампициллина
|
