1.1.1 Анализ публикаций
Прежде чем приступить к экспериментальной работе, коллектив исследователей провел анализ публикаций по изучению адапторных белков содержащих PDZ и LIM домены, данные о способности гена PDLIM4/RIL служить опухолевым супрессором, и о возможности использования этого гена в качестве одного из маркеров разновидности рака молочной железы.
Адапторные белки содержащие LIM и PDZ домены
Основная отличительная черта адапторных белков – наличие нескольких доменов, обеспечивающих белок-белковые взаимодействия. Белки этого класса служат основой для образования крупных сигнальных комплексов, отвечая за правильное проведение сигнала. Они диктуют специфичность межмолекулярных взаимодействий, внутриклеточную локализацию отдельных белков и целых комплексов и могут модулировать активность своих белков-партнеров [1].
Отсутствие у TRIP6 и RIL собственной ферментативной активности, а также наличие PDZ (у RIL) и LIM-доменов (у TRIP6 и RIL) – мотивов, ответственных за белок-белковые взаимодействия, – позволяют отнести их к классу адапторных белков. Рассмотрим структуру и функции этих двух доменов более подробно.
Особенности LIM-доменов
Белки, содержащие LIM-домены, были обнаружены относительно давно. В начале 90-х годов прошлого века были идентифицированы три структурно похожих гена, которые кодировали транскрипционные факторы, содержащие ДНК-связывающий гомеодомен, а также две тандемные копии некоего цистеин-богатого мотива. Это были ген lin-11, участвующий в контроле пролиферации клеток-предшественников вульвы у Caenorhabditis elegans, Isl-1, кодирующий белок, который связывается с энхансером гена инсулина, а также ген mec-3, кодирующий фактор, необходимый для дифференцировки рецепторных нейронов у нематод [2]. Эти высококонсервативные цистеин-богатые структуры, имеющие два тандемно-расположенных цинковых пальца (консенсусная последовательность – C-X2-C-X16-23-H-X2C-X2-C-X2-C-X16-21C-X2-(C/H/D), где X – любая аминокислота) были названы LIM-доменами [3]. Попытки выявить непосредственное связывание LIM-доменов с ДНК успехом не увенчались [4]. На сегодняшний день утвердилась точка зрения, что LIM-домен – домен белок-белковых взаимодействий. Петли цинковых пальцев могут отличаться по длине и аминокислотной последовательности (Рисунок ), что обеспечивает специфичность и широкий спектр белков-интеракторов.
Рисунок . Схематичное изображение аминокислотной структуры LIM-домена.
В настоящий момент в геноме человека идентифицировано 58 генов, кодирующих 135 LIM-доменов. Количество LIM-доменов варьирует от одного до пяти, причем эти мотивы могут быть ассоциированы с совершенно разными функциональными доменами, такими как уже упоминавшийся гомеодомен, каталитические домены или другие домены межбелковых взаимодействий. Интересно отметить, что большинство охарактеризованных LIM-белков могут напрямую или опосредованно связываться с актиновым цитоскелетом (см. ниже).
LIM-домены не имеют собственной каталитической активности. Тем не менее, LIM-белки участвуют во многих биологических процессах за счет связывания с белками-мишенями. На основании анализа большого числа LIM-белков и их взаимодействий было выделено четыре основных механизма, посредством которых они модулируют функции других белков: LIM-белки могут a) действовать как адапторы, b) конкурировать за связывание с мишенями или «вытитровывать» другие белки из сигнальных комплексов, c) менять конформацию других белков или d) локализовать белки-интеракторы в соответствующие компартменты клетки (Рисунок ).
Рисунок . Четыре механизма, посредством которых LIM-белки модулируют функции своих партнеров. а - Адапторы организуют белковые комплексы таким образом, чтобы обеспечить максимальную активность своих партнеров. б - LIM-домен может иметь различное сродство к своим мишеням, и активность LIM-комплекса будет зависеть от конкурентного связывания. в - Некоторые белки могут иметь «открытую» и «закрытую» конформации, и соответственно, разную активность; связывание с LIM-доменом других белков может снимать такое аутоингибирование и способствовать «переключению» из одного состояния в другое. г - LIM-белки могут локализовать себя и/или своих партнеров по связыванию в определенные компартменты клетки.
Недавно в литературе появились сообщения о том, что LIM домен также может обладать Е3-убиквитин-лигазной функцией [5, 6]. Группой ученых под руководством Grusby был идентифицирован LIM-доменный белок SLIM, необходимый для убиквитинирования in vitro и in vivo белка STAT4, который играет ключевую роль в передаче сигнала от цитокинов. Е3-убиквитин-лигазная активность приписывается LIM-домену на основе сходства укладки петель его цинковых пальцев и структуры RING- и PHD-доменов [7] – характерных компонентов убиквитин- и SUMO-лигаз. Тем не менее, прямого доказательства участия именно LIM-домена в переносе активированного убиквитина с Е2-убиквитин-конъюгирующего фермента на белок-мишень представлено не было.
Таким образом, домены межбелковых взаимодействий, включая и LIM-домен, признаны ключевыми компонентами регуляторной системы клетки [8].
Характеристика PDZ-доменов
PDZ-домены были выделены в результате анализа сходных структурных мотивов трех белков: белка postsynaptic density PSD95/SAP90; опухолевого супрессора дрозофилы discs large DlgA и белка, участвующего в поддержании клеточной полярности zonula occludens ZO-1. Изначально этот мотив называли GLGF-доменом из-за часто встречающегося в нем аминокислотного повтора (Gly-Leu-Gly-Phe) или DHR-доменом (disc large homology region), чтобы подчеркнуть его сходство с DlgA. Однако вскоре утвердился акроним PDZ (от PSD95, DlgA, ZO-1) [9].
PDZ-домен – один из самых распространенных мотивов, найденных в геномах с уже определенной первичной последовательностью. По некоторым оценкам, в геноме человека закодировано 440 PDZ-доменов в составе 259 различных белков. В отличие от LIM-доменов, PDZ-домены обнаружены даже у простейших [10]. Тот факт, что «классические» PDZ-домены отсутствуют у дрожжей, но большое разнообразие этих мотивов идентифицированы у бактерий и растений [11], стал основанием для предположения о горизонтальном генетическом переносе таких последовательностей. Отсутствие PDZ-доменов у архей также хорошо согласуется с этой гипотезой [12].
PDZ-домены встречаются почти исключительно в цитоплазматических белках (единственные известные исключения – ядерный белок SLIM [5] и секретируемый цитокин интерлейкин IL-16, однако в случае последнего PDZ домен имеет модифицированное строение [13]) и могут в их составе присутствовать в нескольких копиях (от одной до 13). В зависимости от доменной структуры PDZ-белки подразделяют на 3 семейства. К первому относятся белки, состоящие исключительно из PDZ-доменов. В отличие от многих других белков, состоящих из доменов межбелкового взаимодействия, таким PDZ-белкам не требуется олигомеризация. Второе семейство составляют белки MAGUK (от membrane-associated guanylate kinases). Они содержат от одного до трех PDZ-доменов, один SH3-домен и гуанилат-киназный домен. Интересной особенностью белков этого семейства является то, что их гуанилат-киназный домен не обладает каталитической активностью, а участвует в белок-белковых взаимодействиях. В третье семейство входят белки, содержащие кроме PDZ-мотивов другие домены. В отличие от SH2- или SH3-содержащих белков, PDZ-домены никогда не встречаются в составе тирозин-киназ, однако могут соседствовать с серин-треонин-киназными или фосфатазными доменам. PDZ-белки, не имеющие собственной каталитической активности, выполняют функции адапторов, чаще всего соединяя мембранные рецепторы и сигнальные молекулы в крупные комплексы [14].
PDZ-домены – высококонсервативные 80-100 аминокислотные мотивы, которые сворачиваются в компактную глобулу, состоящую из шести β-листов и двух α-спиралей. «Углубление», образованное вторым β-листом и α-спиралью αB, узнает свой классический лиганд – карбокситерминальный тетрапептид. В зависимости от аминокислотной последовательности пептида узнающие их PDZ-домены были подразделены на три класса [15]. Предпринимались также и другие попытки классификации PDZ-мотивов. Так, анализируя гидрофобность лиганд-связывающих остатков, Besprozvanny и Maximov [16] предложили подразделить PDZ-домены на 25 классов, представители каждого из которых имеют различную лиганд-специфичность.
С течением времени накопились данные о том, что, хотя «каноническим» лигандом для PDZ-домена является карбокситерминальный тетрапептид [17], этот мотив имеет более широкий репертуар возможных взаимодействий. Так, PDZ-домены могут связывать спектрин-подобные мотивы, анкириновые повторы, LIM-домены и другие последовательности. Кристаллографический анализ таких неканонических взаимодействий позволил сформулировать гипотетическое общее правило узнавания PDZ-доменом: лиганд должен иметь экспонированный на поверхности линейный пептидный мотив, заканчивающийся карбоксильной группой или стабилизированный β-поворотом [18]. Было показано, что некоторые PDZ-домены сами содержат такие мотивы, что обусловило возможность ди- или олигомеризации PDZ-белков.
PDZ-белки часто ассоциированы с плазматической мембраной [19]. Недавно была продемонстрирована возможность прямого взаимодействия некоторых PDZ-доменов с фосфотидилинозитол-4,5-дифосфатом (PIP2). Показано, что гидролиз PIP2 в подмембранном пространстве нарушает мембранную локализацию PDZ-белка синтетина. Эти наблюдения свидетельствуют в пользу того, что такой тип взаимодействия может обеспечивать локализацию некоторых PDZ-белков к плазматической мембране [20].
Рисунок суммирует четыре типа взаимодействий PDZ-доменов.
Рисунок . Возможные типы взаимодействий PDZ-доменов. PDZ-домены задействованы в узнавании как минимум четырех типов лигандов: они связывают карбокситерминальные пептиды или внутренние пептидные мотивы, могут олигомеризоваться или взаимодействовать с некоторыми липидами [21].
Итак, белки TRIP6 и RIL содержат функциональные мотивы, обеспечивающие межбелковые взаимодействия. Как описано выше, LIM и PDZ-домены участвуют в сборке сигнальных комплексов, локализации и компартментализации белков-партнеров и регуляции их активности. Рассмотрим известные взаимодействия этих белков более подробно.
|
