Ген TRIP6
TRIP6 (thyroid hormone receptor interacting protein 6 – белок, взаимодействующий с рецептором тиреоидного гормона) – 476-аминокислотный белок семейства зиксина [22], преимущественно экспрессирующийся в эпителиальных клетках [23]. При анализе последовательности белков этого семейства можно выделить две различные по структуре области: N-концевой пролин-богатый участок и C-концевую часть с тремя LIM-доменами. TRIP6 локализуется преимущественно в цитоплазме в области фокальных контактов, однако при некоторых условиях может транспортироваться в ядро, а затем поступать обратно в цитоплазму за счет сигнала ядерного экспорта (СЯЭ) [24]. К настоящему времени о зиксин-подобных белках сложилось представление как об актин-ассоциированных адапторных белках, осуществляющих функциональную связь между цитоплазмой и ядром, где они могут играть роль транскрипционных регуляторов [2].
На данный момент идентифицировано более десятка белков-партнеров TRIP6. Кроме PTP-BL и RIL, в цитоплазме TRIP6 взаимодействует с p130Cas, необходимым для проведения сигналов с интегринов внутрь клетки [25], с компонентом рецепторного комплекса TGF-β белком endoglin [26], а также фосфорилироваться клеточным протоонкогеном c-src [27]. Список белков, взаимодействующих с TRIP6, указывает на возможное участие TRIP6 в регуляции актинового цитоскелета и клеточной подвижности. С другой стороны, известно, что TRIP6 способен взаимодействовать с некоторыми транскрипционными факторами: рецептором тиреоидного гормона THR-β, ретиноидным X рецептором [28], глюкокортикоидным рецептором, c-Fos, p65 (RelA) субъединицей NFκB [29, 30]. При этом TRIP6 может выступать в роли как позитивного, так и негативного регулятора транскрипции. Однако, несмотря на обилие данных, биологическая роль TRIP6 остается неясной.
Ген PDLIM4/RIL
Первое сообщение о гене PDLIM4/RIL появилось в 1995 г. в статье Kiess с соавт. [31]. Целью этой работы был поиск так называемых H-rev генов, т.е. генов, ответственных за поддержание нормального (неопухолевого) роста клеток. Методом вычитающего клонирования были идентифицированы гены, экспрессия которых была подавлена в H-ras трансформированных крысиных фибробластах по сравнению с их фенотипическими ревертантрами, а также с исходной клеточной линией. Неизвестный ранее ген, кодирующей LIM-домен содержащий белок, получил название PDLIM4/RIL (от reversion-induced LIM gene).
Изначально считалось, что у белкового продукта гена PDLIM4/RIL кроме LIM-домена, ответственного за белок-белковые взаимодействия, никакие другие известные мотивы не выявляются. Однако позднее при тщательном анализе его аминокислотной последовательности на N-конце был обнаружен PDZ-домен [32] – мотив, также ответственный за белок-белковые взаимодействия. Таким образом, наличие нескольких модулей для взаимодействия с другими белками, а также отсутствие собственной ферментативной активности указывают на принадлежность PDLIM4/RIL к адапторным белкам, основная функция которых – участие в сборке макромолекулярных комплексов и регуляция активности белков-партнеров.
RIL – представитель семейства белков ALP/Enigma
Семейство ALP (от α-actinin associated LIM protein) и Enigma объединяет несколько родственных PDZ-LIM белков, идентифицированных за последнее десятилетие, многие из которых способны взаимодействовать с α-актинином. Белки ALP/Enigma млекопитающих характеризуются присутствием одного амино-концевого PDZ-домена и одного (подсемейство ALP) или трех (подсемейство Enigma) LIM-доменов на карбоксильном конце. К настоящему времени в литературе утвердилось мнение, что белки этого семейства играют роль в заякоривании актина на мембранных структурах и организации актинового цитоскелета в клетках мышечного и немышечного происхождения.
На данный момент идентифицировано 4 представителя подсемейства ALP млекопитающих: ALP [33], CLP-36 (от carboxyl-terminal LIM domain protein of 36 kDa)/Elfin [34, 35], RIL/PDLIM4 (от PDZ and LIM domain protein) [31, 36] и Mystique/PDLIM2 [37, 38]. В литературе также имеется сообщение о гене PCD1 (от pancreatic cancer derived), кодирующем PDZ-LIM белок [39], однако отсутствие других признаков родства ALP-белкам не позволяет присовокупить его к этому подсемейству. Прототипный белок ALP – на сегодняшний день наиболее охарактеризованный член этой группы. Подсемейство Enigma также объединяет несколько белков: Enigma [40], также описанный как LMP-1 [41], ENH (от Enigma homologue) [42, 43]и ZASP (от Z-band alternatively spliced PDZ-motif protein)/Cypher1 [44, 45], также описанный как Oracle [46].
Итак, белки семейства ALP/Enigma имеют сходные доменную структуру, общую длину и аминокислотную последовательность (Рисунок ). Гомология между RIL и CLP-36 несколько выше, чем между RIL и ALP, и составляет 43% и 41%, соответственно. Наиболее высоко сходство между CLP-36 и ALP – около 50% гомологии [47].
Рисунок . Белки семейства ALP/Enigma позвоночных. PDZ домен обозначен розовым цветом, LIM домен белков подсемейства ALP – зеленым, LIM домены 1, 2 и 3 белков подсемейства Enigma – голубым, синим и лиловым, соответственно; междоменная область закрашена оранжевым. Длины белков (а.о.) указаны справа (использованы последовательности белков мыши).
Происхождение и эволюционная консервативность семейства ALP/Enigma
Недавно у беспозвоночных был обнаружен предковый ген, соответствующий современному семейству ALP/Enigma. В результате анализа полностью просеквенированного генома червя Caenorhabditis elegans идентифицирован единственный ген T11B7.4, получивший впоследствии название alp-1, с которого считывается 4 альтернативно-сплайсированных мРНК. Наиболее короткий транскрипт кодирует C. elegans ALP-гомолог, другие 3 продукта ответственны за синтез трех Enigma-подобных белков (Рисунок ).
Рисунок . Сложная организация alp-1 локуса C. elegans. Ген имеет сложную организацию с двумя сайтами старта и двумя стоп-кодонами и в результате альтернативного сплайсинга кодирует 4 различных транскрипта, обозначенных alp-1a, alp-1b, alp-1c и alp-1d. Цвет экзонов соответствует цвету транслируемых с них доменов. Ген C. elegans alp-1 кодирует одну ALP- и три Enigma-изоформы. Длины белков (а.о.) указаны справа. Интересно, что ALP-1 Enigma-подобные белки имеют 4 LIM-домена, а у ALP-1C отсутствует PDZ-домен.
В отличие от Enigma-подобных белков позвоночных, у C.elegans Enigma-изоформы имеют четыре, а не три LIM-домена. При филогенетическом анализе было продемонстрировано, что N-концевой LIM-домен (LIM1) Enigma-белков C.elegans наиболее близок LIM-домену ALP-белков позвоночных, в то время как LIM2, LIM3 и LIM4 червя родственны LIM-доменам Enigma-белков позвоночных. В геноме плодовой мушки Drosophila melanogaster идентифицирован также единственный ген, кодирующий и ALP, и Enigma-изоформы. Структура результирующих белков весьма близка таковой у C.elegans.
Таким образом, ген alp/enigma беспозвоночных (D.melanogaster и C.elegans) представляет собой предковую форму, которая в процессе эволюции в результате дупликаций и мобилизации дала начало сложно организованному семейству ALP/Enigma позвоночных. Действительно, в геноме человека обращает на себя внимание попарное распределение генов подсемейств ALP и Enigma на хромосомах. Так, ALP картируется в локусе 4q35 недалеко от ENH (4q22); CLP-36 (10q22-26.3) рядом с Cypher/ZASP (10q22.3-23.4); RIL (5q31.1) локализован на 5-й хромосоме вместе с Enigma (5q35.3) [48]. Подсемейство Enigma эволюционно возникло несколько раньше и присутствуют уже у хордовых [49, 50], в то время как гены подсемейства Alp описаны только у позвоночных [51, 52].
Ген PDLIM4/RIL человека впервые был клонирован в нашей лаборатории Башировой с соавт. в ходе экспериментов по определению физической карты кластера цитокиновых генов, расположенного на 5-й хромосоме человека [36]. Рассмотрим геномную структуру человеческого гена PDLIM4/RIL более подробно.
Геномная организация гена PDLIM4/RIL человека
Хромосомная локализация гена PDLIM4/RIL была впервые определена в работе Szpirer с соавт. [53], целью которой явилось картирование трех H-rev генов, идентифицированных ранее. У крысы ген PDLIM4/RIL был локализован на 10-й хромосоме, а у человека – на 5-й.
Эти результаты полностью согласуются с данными, полученными в нашей лаборатории в ходе работы по поиску новых генов в районе кластеризации генов цитокинов на 5-й хромосоме человека в области 5q31.1 [36]. В результате проведенной кДНК-селекции на космидных клонах в районе между генами IRF1 и CSF2 картирован человеческий ген PDLIM4/RIL (Рисунок ).
Рисунок . Физическая карта геномного участка из хромосомного сегмента 5q31.1 человека. Черными прямоугольниками и стрелками указаны соответственно положения и ориентации генов IL3, IL4, IL5, IL13, IRF1, RAD50 и картированного гена PDLIM4/RIL. Сверху указана локализация космидных клонов, снизу – YAC-клонов. M – MluI, N – NotI.
При изучении интрон-экзонной структуры было установлено, что ген PDLIM4/RIL состоит их 7 экзонов и имеет геномную длину около 14.5 т.п.н. (Рисунок ). При этом PDZ-домен кодируют два 5’-концевых экзона, а LIM-мотив – два экзона на 3’-конце (Рисунок , I).
Рисунок . Рестриктная карта космидного клона 30D8 и экзон-интронная структура гена PDLIM4/RIL человека с указанием размеров экзонов и примерного размера интронов. Экзоны изображены с помощью черных прямоугольников. Стрелками обозначены сайты сплайсигна. R – EcoRI, H – HindIII, B – BssHII, S – SacII, F – SfiI.
Альтернативные транскрипты гена PDLIM4/RIL человека
По оценкам, сделанным в процессе анализа данных Celera Genomics и проекта «Геном человека», наш геном кодирует всего около 30 тысяч генов, т.е. намного меньше, чем предполагалось ранее [54, 55, 56]. Такое относительно небольшое число генов может быть компенсировано за счет альтернативного сплайсинга, дающего возможность получить несколько белковых продуктов для каждого гена. Результаты анализа полной последовательности генома и экспрессионных баз данных методами биоинформатики позволяют утверждать, что до 40-60% генов человека имеют по крайней мере одну альтернативно-сплайсированную изоформу [57].
При изучении экспрессии гена PDLIM4/RIL в образцах РНК фетального мозга человека с помощью ОТ-ПЦР с концевыми праймерами кроме ожидаемого продукта, содержащего все 7 экзонов PDLIM4/RIL , был также получен более короткий продукт, где отсутствовал 6-й экзон (Рисунок , II). В результате такого альтернативного сплайсинга происходит сдвиг рамки считывания, и появляется более ранний стоп-кодон. Все это приводит к исчезновению LIM-домена и укорочению белкового продукта на 84 аминокислотных остатка.
IV
IIIUI
II
I
Рисунок . Схематическое изображение четырех альтернативных транскриптов гена PDLIM4/RIL и соответствующих им белков. Участки, кодирующие PDZ-домен, залиты розовым цветом, область, соответствующая LIM-домену, обозначена темно-зеленым, а междоменный участок - оранжевым. При делеции 6-го экзона происходит сдвиг рамки считывания (обозначено на рисунке голубым цветом), что приводит к появлению нового стоп-кодона и, соответственно, укорочению белкового продукта на 84 аминокислотных остатка. При делеции 2-го и 3-го экзонов сдвига рамки считывания не происходит.
ОТ-ПЦР анализ образцов РНК клеток линии Daudi (B-клеточная лимфома) выявил 4 альтернативных варианта гена RIL (Баширова с соавт., неопубликованные данные). Более длинные трансткрипты I и II полностью соответствовали двум транскриптам, идентифицированным ранее. В более коротком транскрипте III делетированы 2-й и 3-й экзоны, кодирующие большую часть PDZ-домена. В этом случае, однако, сдвига рамки считывания не происходит, и предсказанный белковый продукт сохраняет C-концевой LIM-домен. Транскрипт IV комбинирует в себе описанные ранее делеции: в нем отсутствуют как 2-й и 3-й, так и 6-й экзоны. Его предсказанный белковый продукт будет иметь ущербный PDZ-домен на N-конце и альтернативный пептид вместо LIM-домена на C-конце, сохраняя неизменной лишь междоменную область (Рисунок , I-IV).
Позднее также был идентифицирован пятый альтернативный транскрипт PDLIM4/RIL с длинной 3’-нетранслируемой областью за счет наличия альтернативного неканонического сигнала полиаденилирования (AAGTAAA) в сильно удлиненном 7-и экзоне. Белок-кодирующая область этого альтернативного транскрипта была неизменной.
На данный момент утвердилась точка зрения, что генные дупликации и явление альтернативного сплайсинга – два возможных молекулярных эвоционных механизма, ведущих к генетической диверсификации [58]. Нельзя исключить, что мы наблюдаем появление новых функций PDLIM4/RIL , о чем свидетельствует такое обилие альтернативно сплайсированных транскриптов. Альтернативный сплайсинг, приводящий к появлению белков с разными комбинациями PDZ и LIM-доменов, скорее всего, является механизмом регуляции функций этих мотивов и связывающихся с ними белков. Наличие пятого альтернативного транскрипта с длинной нетранслируемой областью может быть частью механизма регуляции трансляции белка.
Феномен альтернативного сплайсинга описан и для других генов семейства ALP/Enigma. Так, на данный момент идентифицировано 6 изоформ ZASP/Cypher, две из которых, подобно PDLIM4/RIL, имеют лишь PDZ-домен [59]. Очевидно, что в данном случае за счет альтернативного сплайсинга осуществляется его тонкая функциональная регуляция. Так, половина альтернативных форм Cypher экспрессируется только в скелетных мышцах, в то время как остальные варианты специфичны для сердца [45, 59]. В процессе эмбриогенеза баланс экспрессии разных изоформ также постоянно меняется [59]. Для ENH на данный момент описано по меньшей мере 4 альтернативно-сплайсированные изоформы, у трех из которых отсутствуют все три LIM домена. Предполагается, что функционируют такие укороченные варианты как доминантно-негативные регуляторы полноразмерного белка [60]. Mystique/PDLIM2 кодирует по меньшей мере 3 изоформы, дифференциально экспрессируемые в различных тканях [37]. В литературе имеется упоминание о существовании двух альтернативных форм ALP – гладкомышечной smALP и скелетной skALP [61]. Как уже упоминалось ранее, альтернативный сплайсинг – основной механизм, обеспечивающий разнообразие белков ALP/Enigma у беспозвоночных. У червя С.elegans существует вариант белка с отсутствующим PDZ-доменом [48], подобный RIL-изоформе III.
Эволюционная консервативность PDLIM4/RIL
Ген PDLIM4/RIL эволюционно консервативен, что было показано при перекрестной гибридизации с геномной ДНК крысиного, мышиного, хомячьего, человеческого, обезьяньего и куриного происхождения [31]. В базе данных GenBank имеются высокогомологичные (более 80%) полные копии кДНК для мыши, крысы и человека. Размер кДНК составляет около 1100 т.п.н., которые соответствуют 328-330 а.о. LIM-домен расположен на C-конце.
Анализ экспрессии PDLIM4/RIL и других членов семейства ALP/Enigma в различных тканях
К настоящему моменту накоплено достаточно много данных об экспрессии членов этого семейства. Белки подсемейства Enigma были найдены преимущественно в поперечно-полосатых мышцах, где они локализуются в области Z-линий [40, 43-46, 48]. Считается, что белки этого подсемейства необходимы для поддержания структуры Z-линий при мышечном сокращении. Так, было показано, что мыши с нокаутированным Cypher умирают вскоре после рождения вследствие тяжелой миопатии [62]. Более того, мутации Cypher ассоциированы с дилатационной кардиомиопатией у людей [63]. Тем не менее появляются данные и о других тканях, где могут экспрессироваться Enigma-подобные белки. При обработке срезов 15.5-дневного эмбриона мыши (Е15.5) поликлональными антителами, специфичными к ENH, наиболее сильно оказались окрашены гладкие и скелетные мышцы, однако экспрессия этого белка также детектировалась в нейронах центральной нервной системы, в дорсальных корешковых ганглиях, а также в хромаффинных клетках медуллы надпочечников [64]. При Нозерн-блот гибридизации с образцами полиаденилированной РНК из разных органов человека наибольший уровень ENH была зафиксирована в сердце и мышечной ткани, хотя экспрессия этого гена детектировалась и в других тканях [65]. Эти и некоторые другие данные указывают на возможное участие этих белков в развитии нервной системы.
По сравнению с подсемейством Enigma, ALP-подобные белки экспрессируются не только в поперечно-полосатых мышцах. Так, Alp детектируется исключительно в мышцах, сердце и тканях, обогащенных гладкомышечными клетками (артерии, желудок, кишечник, легкое), взрослой крысы, пятнадцатидневного эмбриона крысы (E15) и человека [33], четырнадцатидневного мышиного эмбриона (E14) [47] и девятнадцатидневного куриного эмбриона [61]. В последней работе также описано весьма интересное наблюдение: уровень белка Alp значительно повышался во время миогенной дифференцировки (в период между 11-м и 18-м днями развития куриного эмбриона), подчеркивая его важность для формирования мышц. Развитие in utero дилатационной кардиомиопатии правого желудочка, наблюдаемой у мышей, нокаутных по гену Alp [66], даже при отсутствии патологии скелетных мышц [67] полностью согласуется с этими результатами. Небезынтересно, что у человека ген ALP картируется в области 4q35 вблизи от гетерохроматинового локуса, ассоциированного с фасциоскапулогумеральной мышечной дистрофией [68] – наиболее распространенной аутосомно-доминантной мышечной дистрофией.
В отличие от ALP CLP-36, RIL и Mystique также экспрессируются во многих немышечных клетках. Так, у мыши на разных стадиях эмбрионального развития Clp-36 детектируется в печени, коже и эпителии ротовой полости, пищеварительной системы, матки, мочевого пузыря, легкого и в эндотелии. Весьма высокий уровень экспрессии наблюдался в развивающемся сердце четырнадцатидневного эмбриона (E14). Экспрессия Clp-36 в гладкомышечных клетках и в поперечно-полосатых мышцах не детектировалась [47, 69, 70]. Подобно Clp-36, у мыши Mystique в скелетных мышцах не экспрессируется. Методом Нозерн-блот гибридизации наибольший его уровень зарегистрирован в легких, также эта мРНК детектируется в почке, яичке, селезенке и в меньшей степени в сердечной мышце. В мозге и сердечной мышце неожиданно была обнаружена экспрессия наиболее короткой изоформы Mystique с отсутствующим LIM-доменом [37].
Подобно CLP-36 и Mystique RIL детектируется преимущественно в эпителиальных тканях, однако наблюдаются значительные отличия в паттернах экспрессии этих генов. Картина экспрессии Ril, полученная с помощью in situ гибридизации в мышиных тканях, указывает на возможную физиологическую роль продукта этого гена в эпителиальных клетках бронхов и альвеол, фаллопиевых труб и желудка, а также в постмитотических нейронах мозга. Возможна также его роль в дифференцировке сперматогоний в сперматиды [31]. С этими результатами хорошо согласуется факт обнаружения Ril в легком, мозге, яичнике и матке четырнадцатидневного мышиного эмбриона [47]. При анализе экспрессии RIL в тканях 20-недельного эмбриона человека, проведенном в нашей лаборатории методом Нозерн-гибридизации, наиболее высокий уровень мРНК был зафиксирован в головном мозге, продолговатом и спинном мозге; также RIL детектировался в тимусе, почке, тонкой кишке и в меньшей степени в сердце и легком [Баширова с соавт., неопубликованные данные].
Сравнение паттернов экспрессии RIL и CLP-36 наводит на мысль о различной, хотя и частично перекрывающейся физиологической роли продуктов этих генов. Для того, чтобы приблизиться к пониманию возможной функции RIL, обратим более пристальное внимание на доменную структуру этого белка, на его локализацию в клетке и на его партнеров по взаимодействию.
Репертуар взаимодействий белка RIL
На сегодняшний день устоялось мнение, что PDZ-LIM белки принимают активное участие в поддержании структуры и регуляции динамики актинового цитоскелета в клетках как мышечного, так и немышечного происхождения. Взаимодействие с α-актининами или другими структурными белками цитоскелета как правило осуществляется через PDZ домен белков семейства ALP/Enigma [33, 44, Error! Bookmark not defined., 69, 71, 72]. Кроме того, PDZ-LIM белки участвуют в регуляции активности транскрипционных факторов [64, 73, 74], киназ [42, 44, 75, 76], кальциевых каналов [77], рецепторов [40] и рецепторных тирозин-киназ [78] и других сигнальных молекул [79]. В этом отношении RIL – также не исключение: среди его партнеров были идентифицированы протеинтирозинфосфатаза PTP-BL, актин-ассоциированный LIM-белок TRIP6, компонент актиновых стресс-фибрилл α-актинин-1 и глутаматный AMPA-рецептор GluR1.
RIL взаимодействует с протеинтирозинфосфатазой PTP-BL
Первый белок-партнер RIL описал Cuppen с соавт. [32]. Эта группа исследователей занималась изучением свойств мышиной протеинтирозинфосфатазы PTP-BL. При поиске белков, взаимодействующих с PTP-BL, с помощью дрожжевой двухгибридной системы было обнаружено, что данный белок посредством своих PDZ-доменов связывается с LIM-доменом белка RIL (как мышиного, так и человеческого).
Мышиный PTP-BL (или PTP-Bas человека) – крупный цитоплазматический белок массой 270кДа, имеющий модулярную структуру. На его N-конце он содержит киназный некаталитический домен KIND с неясной функцией. За ним следует FERM-домен. Считается, что эти домены обеспечивают связь между мембранными рецепторами и актиновым цитоскелетом. На C-конце PTP-BL расположен тирозинфосфатазный домен, каталитическая активность которого была продемонстрирована in vitro. Между FERM и PTP-доменами расположены пять PDZ-доменов [80], которые и использовались в качестве зонда при скрининге библиотеки кДНК с помощью двухгибридной системы.
Было показано, что для связывания PTP-BL с белком RIL необходимо и достаточно наличие второго или четвертого PDZ-домена PTP-BL и LIM-домена RIL. Этот результат был подтвержден in vivo в экспериментах по коиммнопреципитации двух белков с помощью поликлональных антител. Этот результат был опровергнут в более поздней работе авторов [18]. В результате более тщательного исследования было установлено, что с PDZ-доменом PTP-BL взаимодействует C-концевой участок RIL, а LIM-домен играет лишь стабилизирующую роль.
Также было установлено, что RIL-LIM фосфорилируется по тирозиновому остатку Y274 как in vitro, так и in vivo и дефосфорилируется фосфатазным доменом PTP-BL in vitro [32]. Все эти данные стали первым прорывом в функциональном изучении гена RIL.
Краткая функциональная характеристика PTP-Bas/PTP-BL
PTP-Bas была впервые клонирована в ходе работы по поиску новых протеинтирозинфосфатаз с использованием ПЦР-амплификации консервативных каталитических участков из линии клеток базофилов, откуда и получила свое название. Мышиный гомолог был назван соответственно PTP-basophil-like (сокращенно PTP-BL). О сложности и разнообразии функций этой молекулы можно судить по белкам, с которыми она взаимодействует.
Пожалуй, наиболее интересным является участие PTP-Bas в Fas-индуцированном апоптозе (другое название PTP-Bas – Fas-associated phosphatase 1, или FAP-1). Своим вторым PDZ-доменом PTP-Bas связывается с Fas и тем самым негативно регулирует активацию сигнального каскада, инициируемого при взаимодействии Fas с Fas-лигандом. Считается, что именно гиперэкспрессия PTP-Bas в клетках рака яичника делает их резистентными к Fas-индуцированному апоптозу [81].
PTP-Bas также может участвовать в регуляции активности транскрипционного фактора NFκB. Это происходит за счет взаимодействия первого PDZ-домена PTP-Bas с анкириновыми повторами IκBα. Более того, PTP-Bas способна дефосфорилировать IκBα, тем самым, по-видимому, препятствуя диссоциации комплекса NFκB-IκBα [80].
Наиболее важным для понимания функции PTP-Bas является идентификация субстратов ее форфатазного домена. Было показано, что протоонкогены v src и β-catenin могут быть дефосфорилированы с участием PTP-Bas in vitro, однако функциональная значимость таких событий остается неизученной. Тем не менее, взаимодействие PTP-Bas с β-катенином, по всей видимости, неслучайно. Об этом может свидетельствовать факт взаимодействия со вторым PDZ-доменом PTP-Bas хорошо изученного опухолевого супрессора APC [82]. Связывая β-катенин цитоплазме, APC препятствует его транслокации в ядро и, следовательно, активации транскрипции в комплексе с транскрипционным фактором TCF/Lef [83].
О вовлеченности PTP-Bas/PTP-BL в регуляцию структуры актинового цитоскелета может свидетельствовать факт ее участия в цитокинезе [84]. Недавно также описан фенотип мышей, нокаутных по PTP-BL: у этих животных нарушена репарация моторных нейронов, однако более серьезных изменений не выявлено. Авторы статьи считают, что такой «мягкий» фенотип – отражение роли PTP-BL как основы для сборки сигнальных комплексов, а не отсутствия фосфатазной активности [85].
RIL взаимодействует с LIM-доменным белком TRIP6
Работа по поиску партнеров RIL по связыванию была продолжена, и первые результаты были получены уже в 2000 году. На этот раз в качестве «наживки» в дрожжевой двухгибридной системе был использован PDZ-домен RIL. Было установлено, что этот участок RIL связывается со вторым и, в меньшей степени, с третьим LIM-доменом белка TRIP6. Также при этом скрининге был выделен клон, весьма неожиданно кодировавший LIM-домен самого RIL. Таким образом, RIL может димеризоваться за счет взаимодействия RIL-LIM c RIL-PDZ. В том же исследовании было показано, что TRIP6 также связывается с PTP-BL. Релевантность этих взаимодействий была подтверждена с помощью коиммунопреципитации отдельных мотивов этих белков. Наконец, с помощью поликлональных антител, специфичных для PTP-BL, RIL и TRIP6, была определена внутриклеточная локализация этих белков. Оказалось, что в клетках карциномы линии A431 все три белка колокализуются в субмембранной области, богатой фибриллярным актином. Кроме того, значительные количества PTP-BL и TRIP6 находились в ядре [86].
Роль RIL в поддержании структуры актиновых стресс-фибрилл
Ранее уже отмечалось, что представители семейства ALP, к которому относится и RIL, белки ALP и CLP-36 посредством своих PDZ-доменов взаимодействуют с спектрин-подобными повторами α-актининов и колокализуются в клетках с актиновыми стресс-фибриллами [33, 61, 69]. Отсюда логично вытекало предположение, что RIL также может ассоциироваться с актиновым цитоскелетом. Эта гипотеза была подтверждена в работе Vallenius с соавт. [47].
Первым шагом в исследовании функции белка RIL было определение его внутриклеточной локализации. По причине отсутствия коммерчески-доступных RIL-специфичных антител авторы этого исследования были вынуждены создать конструкцию для экзогенной экспрессии этого белка, слитого с эпитопом Myc. При иммунофлюоресцентной окраске клеток, в которые была введена такая конструкция, RIL действительно колокализовался с полимеризованным актином, окрашенным фаллоидином. Однако в RIL-экспрессирующих клетках наблюдались драматические изменения в морфологии актинового цитоскелета: в них обнаруживались атипично толстые волокна и актиновые кластеры (Рисунок ). Подобная картина наблюдалась не только в клетках остеосаркомы U2OS, но и эпителиального (А549) происхождения и в фибробластах (COS-7). Дальнейшие эксперименты по частичному разрушению актинового цитоскелета детергентом или цитохалазином B позволили сделать вывод, что RIL является компонентом стресс-фибрилл.
Рисунок . RIL локализуется на актиновых стресс-волокнах. Конструкция для экспрессии Myc-RIL была транзиентно введена в клетки остеосаркомы U2OS с помощью трансфекции. Клетки подвергли двойной флюоресцентной окраске Myc-специфичными моноклональными антителами (A) для детекции Myc-RIL и Texas Red-конъюгированным фаллоидином (B) для визуализации актиновых филаментов. (C) – появление желтого цвета говорит о колоколизации RIL с актиновыми волокнами.
Нахождение RIL на актиновых волокнах могло говорить о том, что, подобно ALP и CLP-36, RIL может взаимодействовать с α-актинином. Это предположение было подтверждено в экспериментах по коиммунопреципитации этих белков, введенных экзогенно. При более детальном исследовании было установлено, что RIL связывается с α-актинином своим PDZ-доменом и за счет этого облегчает взаимодействие α-актинина с актиновыми филаментами.
В работе было предложено два возможных механизма формирования нерегулярных актиновых фибрилл. Во-первых, RIL может рекрутировать α-актинин в формирующиеся волокна или стабилизировать взаимодействие α-актинина с актиновыми филаментами. Альтернативный механизм возникновения толстых актиновых фибрилл – дефект при их разборке.
Так или иначе, было убедительно показано, что RIL участвует в регуляции структуры и динамики актинового цитоскелета.
Краткая характеристика α-актининов
α-Актинины – группа из четырех высокородственных генов, продукты которых были изначально описаны как белки, образующие поперечные сшивки между актиновыми филаментами в поперечно-полосатых мышцах. Однако с течением времени экспрессия α-актининов была обнаружена и в гладких мышцах, и в немышечных типах клеток, где они локализуются в области межклеточный контактов, фокальных контактов, в ламеллиподиях и вдоль актиновых стресс-волокон мигрирующих клеток.
Функционально α-актинин представляет собой антипараллельный гомодимер, состоящий из полипептидных цепей массой около 100 кДа. На N-конце белка содержится актин-связывающий домен (ABD – actin-binding domain), состоящий из двух CH-доменов (calponin homology), гомологичных кальпонину. С-конец молекулы образован кальмодулин-подобным (СaM) доменом, связывающим ионы кальция. Описанные структуры соединяются четырьмя спектриновыми повторами, обеспечивающими гомодимеризацию α-актинина, в результате чего образуется жесткий удлиненный «ствол» с актин-связывающими доменами на обоих концах, длина которого определяет расстояние между актиновыми фибриллами. ABD соединен со «стволом» гибким шарнирным участком, позволяющим соединять как параллельные, так и антипараллельные актиновые пучки. Таким образом, геометрия актинового каркаса, по-видимому, зависит от присутствия дополнительных структурных белков [87].
α-Актинин имеет три основных функции. 1. Это основной белок, который образует поперечные сшивки актиновых филаментов Z-диска поперечно-полосатых мышц, соединяя соседние саркомеры. 2. α-Актинин локализуется в подмембранном пространстве, где связывает кортикальный актин с интегринами и трансмембранными рецепторами, а также обеспечивает стабильность структуре фокального контакта. 3. В немышечных клетках он является основным компонентом актиновых стресс-волокон.
На данный момент идентифицировано 4 изоформы α-актинина: две немышечных (1 и 4) и две мышечных (2 и 3). Несмотря на крайне высокую гомологию (86% идентичности аминокислотной последовательности) α-актинины 1 и 4 имеют дивергентные функции: Подоциты мышей, нокаутных по изоформе 4, имеют аномальную морфологию, хотя и экспрессируют α-актинин-1, и у таких животных развивается гломерулярный склероз, приводящий к тяжелой почечной недостаточности. Кроме того, известно, что экспрессия α-актинина-4 значительно повышается в мигрирующих клетках [88]. α-Актинин-2 человека высоко экспрессируется во всех типах мышечных клеток, а изоформа 3 встречается только в некоторых типах быстрых волокон. Более того, у некоторой части человеческой популяции α-актинин-3 отсутствует, что, однако, не связано с развитием каких-либо патологий. Этот факт говорит о полном перекрывании функций этих изоформ [89].
На данный момент выявлено четыре основных механизма регуляции α-актинина: 1. ограниченный протеолиз (кальпаин расщепляет α-актинин в процессе деадгезии), 2. связывание с фосфоинозитил-интермедиатами (снижает сродсво к β-интегринами и актину), 3. фосфорилирование тирозин-киназами (в частности, фосфорилирование киназой фокальных контактов FAK препятствует взаимодействию α-актинина с актином) и 4. связывание с Ca2+ (снижает аффинность к актину). Мышечные изоформы α-актинина, однако, потеряли способность связывать ионы кальция, что, по-видимому, защищает структуру мышечных волокон от дестабилизирующего эффекта кальция во время Са2+-индуцированных сокращений [90]. Идентифицированы и другие белки-партнеры α-актинина, среди них можно отметить МАР-киназы, LIM-доменные адапторные белки, глутаматные NMDA рецепторы.
В последние годы становится очевидно, что α-актинин – не только белок, образующий сшивки актиновых филаментов, но и важный регулятор организации фокальных контактов и цитоскелет-связанный «плацдарм» для сборки сигнальных комплексов [91].
Транспортная функция RIL
Итак, белки семейства ALP в своем составе имеют два функциональных модуля: с помощью PDZ-домена они связаны со структурым компонентом актиновых фибрилл α-актинином, а при этом LIM-домен остается свободным для взаимодействий с некоторыми киназами и другими сигнальными белками. В этом свете идея о возможной транспортной функции PDZ-LIM белков не выглядит безосновательной. Такая гипотеза была сформулирована в работе Vallenius [75] (см. Рисунок ).
Рисунок . Белки семейства ALP могут выполнять транспортную функцию. Согласно этой гипотезе ALP-белки своим PDZ-доменом заякорены на α-актинине, а LIM-домен остается свободным для других взаимодействий.
Это предположение вскоре нашло свое подтверждение в работе Shulz с соавт. [92]. Статья посвящена поиску механизмов транспорта в нейронах глутаматных AMPA-рецепторов на поверхность синаптической поверхности и их рециклизации. Известно, что цитоскелет нейронов состоит преимущественно из актиновых волокон, разрушение которых влияет катастрофически на концентрацию синаптических AMPA-рецепторов и передачу нервных сигналов.
В ходе работы с помощью двухгибридной дрожжевой системы, метода, уже не раз подтвердившего свою эффективность, было установлено, что одна из субъединиц глутаматного рецептора GluR-A связывается с LIM-доменом белка RIL, который в свою очередь через PDZ-домен взаимодействует с α-актинином. В пользу функциональной значимости образования такого комплекса свидетельствует тот факт, что RIL может быть коиммунопреципитирован с GluR-A in vivo. Более того, в экспериментах по субклеточному фракционированию лизатов переднего мозга наиболее обогащена белком RIL оказалась именно постсинаптическая фракция. Следует обратить внимание, что в предшествующих исследованиях наибольшая экспрессия RIL была отмечена именно в тканях мозга (см. стр. Error: Reference source not found).
Верификация функции RIL в транспорте AMPA-рецепторов была проведена на первичной культуре нейронов гиппокампа. Было установлено, что гиперэкспрессия этого белка в нейронах приводит к 2,5-кратному обогащению глутаматных рецепторов в области синапсов и 25% усилению AMPA-зависимых синаптических токов, для чего было необходимым наличие неповрежденных LIM и PDZ-доменов.
Таким образом, полученные данные предполагают непосредственное участие белка RIL в транспорте и правильной локализации AMPA-рецепторов в нейронах мозга.
Возможное участие RIL в злокачественной трансформации
Структура и динамика актинового цитоскелета сопряжены с рядом сигнальных путей и, в частности, принимают участие в регуляции клеточной адгезии, распластывании и миграции клеток. Состояние цитоскелета влияет также на процессы деления клеток и их злокачественную трансформацию. В этом свете представляет интерес уточнение потенциальной роли RIL в канцерогенезе.
Первое упоминание о RIL было сделано в работе, посвященной выявлению различий между HRAS-трансформированными крысиными фибробластами и родственными им фенотипически нормальными клетками [31]. Было показано, что экспрессия RIL значительно подавлена в клетках с введенными онкогенами Ras или Raf, но полностью восстанавливалась в независимых фенотипических ревертантах. Такое «поведение» позволило отнести RIL к потенциальным опухолевым супрессорам.
Через несколько лет в свет вышло новое исследование, ставившее своей целью поиск генов, задействованных в образовании злокачественных опухолей. В этой работе сравнивались библиотеки кДНК из нормальных первичных куриных фибробластов CEF и тех же клеток, трансформированных вирусным онкогеном v-Jun. В результате субстракционного клонирования было идентифицировано 6 генов, экспрессия которых значительно повышалась при злокачественной трансформации. Одним из этих генов оказался куриный гомолог RIL. При анализе панели CEF, трансформированных мутантами v-Jun с различной трансформирующей способностью, выяснилось, что экспрессия RIL напрямую коррелировала со степенью злокачественности клеток, т.е. в условиях этой модели RIL проявлял себя как потенциальный онкоген. Тем не менее, гиперэкспрессия RIL в куриных фибробластах к трансформации или детектируемому изменению морфологии или скорости пролиферации не привела [93].
Недавно в литературе появилось сообщение о подавлении уровня мРНК RIL при раке простаты. При углубленном изучении этого феномена выяснилось, что в более чем 90% проанализированных опухолевых образцах наблюдалось аберрантное гиперметилирование промоторной области этого гена по сравнению с окружающей нормальной тканью от того же пациента. Авторы исследования даже предлагают использовать подавление RIL в комбинации с анализом экспрессии нескольких других генов в качестве маркера рака простаты [94]. Эти данные прекрасно согласуются с другими сообщениями о репрессии RIL при злокачественной трансформации [31, 95, 96].
Итак, на сегодняшний день данные об участии RIL в онкогенезе все еще весьма разрозненны и противоречивы. Роль RIL в этом процессе остается неясной, но можно предположить, что она зависит от конкретных механизмов трансформации.
Данные о дифференциальной экспрессии RIL, полученные с использованием микропанелей олигонуклеотидов
За последние годы благодаря взрывообразному развитию технологии микрочипов был накоплен значительный массив данных об экспрессии генов. Выводы, сделанные при анализе этой информации, могут служить отправными точками в поиске и изучении функций гена RIL. Обратимся к некоторым данным, опубликованным на этот счет к сегодняшнему дню.
Авторы одного из первых подобных исследований ставили своей целью поиск отличий париетальных (продуцирующих кислоту) клеток от других типов клеток выстилки желудка. Ген RIL был идентифицирован в составе молекулярной сигнатуры из 92 генов, экспрессия которых достоверно повышена в париетальных клетках. Высокий интерес к изучению клеток выстилки желудка обусловлен необходимостью выявления механизмов развития гастритов и пептических язв желудка, являющихся важной медико-социальной проблемой [97].
Другое исследование было посвящено поиску генов-мишеней гетеродимерного транскрипционного фактора SIM1/ARNT2. В культивируемых нейрональных клетках с тетрациклин-индуцируемой гиперэкспрессией этих белков активация конструкции приводила к повышению уровня RIL почти в два раза. Известно, что корректное функционирование этого транскрипционного фактора необходимо для дифференцировки нейроэндокринных органов в гипоталамусе мыши. Установлено, что мутации SIM1 приводят к раннему развитию ожирения у мышей, а повреждения этого гена у человека ассоциированы с излишним весом [98].
Недавно появилось сообщение, что, параллельно с генами белков острой фазы, экспрессия RIL значительно повышается в Мюллеровых глиальных клетках сетчатки при диабете, что подразумевает участие RIL в воспалительных процессах. Исследование было проведено на крысиной модели диабета, вызванного стрептозотоцином [99].
Приведенные данные ясно показывают, сколь многообразны процессы, в которых задействован RIL. Массив подобной информации неустанно продолжает расти, открывая все новые грани функции этого гена.
Из других данных, которые могут помочь понять функцию RIL, обращает на себя внимание сообщение, увидевшее свет в 2003 году. В этой статье обсуждается возможное участие гена RIL в развитии остеопороза, т.е. снижении минеральной плотности и разряжении костной ткани. Авторы исследования проанализировали образцы ДНК, выделенной из крови 370 японских женщин, как здоровых, так и больных остеопорозом. Была установлена корреляция между точечным полиморфизмом –3333T→C от точки начала транскрипции RIL и повышенными риском развития этого заболевания. Эти результаты подразумевают участие RIL в дифференцировке остеобластов и регуляции метаболизма костной ткани [100].
|
