Молекулярно-генетическая природа первичных гемофагоцитарных лимфогистиоцитозов в россии

Скачать 347.9 Kb.

Название	Молекулярно-генетическая природа первичных гемофагоцитарных лимфогистиоцитозов в россии
страница	2/4
Дата публикации	03.04.2015
Размер	347.9 Kb.
Тип	Автореферат

100-bal.ru > Литература > Автореферат

1 2 3 4

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для исследования использовали образцы геномной ДНК 26 семей с клиническим диагнозом FHL (28 больных ребенка, 37 здоровых родственников) и 11 мальчиков с клиническим диагнозом XLP из различных регионов России (рисунок 1). Все пациенты обследованы или проконсультированы в РДКБ (Республиканской детской клинической больницы) или ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии».

Анализ клинических характеристик и исследование клинико-генетической корреляции проводились на основании ретроспективного анализа доступной медицинской документации. Статистический анализ выполнен в программе Statistica 7.0. Сравнение средних и медиан выполнено с помощью точного теста Фишера. Расчет общей выживаемости по методу Kaplan-Meier. Сравнение выживаемости между группами на основании log-rank теста.

Контрольная выборка взята из банка лаборатории ДНК диагностики МГНЦ РАМН. Её составили 100 необследованных детей того же возраста из различных регионов России (50 мальчиков и 50 девочек).

Выделение геномной ДНК проводили с помощью набора DNA Prep 100 Diatom ^TM из образцов периферической крови.

Исследование генов PRF1, UNC13D, STX11, STXBP2, RAB27A, BIRC4 и SH2D1A проведено с помощью прямого автоматического секвенирования кодирующих областей генов, включая области экзон-интронных соединений. Амплификация необходимых фрагментов геномной ДНК проведена методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия) Все фрагменты секвенированы с обеих цепей ДНК с использованием Big Dye Terminator’s v 1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) и генетического анализатора ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystems), анализ результатов секвенирования проведен с помощью программы Chromas.

В случае обнаружения у пациента двух мутаций в одном гене, проведено исследование образцов ДНК родителей для подтверждения транс-положения обнаруженных изменений нуклеотидной последовательности.

При исследовании гаплотипа основателя для повторяющихся мутаций в гене UNC13D были выбраны 8 микросателлитных маркеров на хромосоме 17q25, расположенных в области размером 7,4 млн.п.н. вокруг исследуемого гена. Физическая и генетическая локализация маркеров на хромосоме оценена с помощью карт Sequence и Marshfield той же базы. Для каждого из маркеров выбраны и синтезированы пары праймеров. Амплификацию фрагментов проводили в стандартных объеме и составе реакционной смеси. Результаты оценены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD в УФ-излучении.

Для одновременного обнаружения трех наиболее часто встречающихся мутаций в гене UNC13D использовали мультиплексную амплификацию. Такая реакция позволяет одновременно амплифицировать и регистрировать несколько фрагментов разной длины. Этот метод значительно дешевле, проще и быстрее, чем прямое автоматическое секвенирование.

При выявлении у пациентов ранее неописанных нуклеотидных замен, которые приводят к изменениям в аминокислотных последовательностях, исследованы частоты их встречаемости в контрольной группе методом ПДАФ- или ПДРФ-анализов.

Результаты и обсуждение

Исследование кодирующей последовательности генов в группе FHL пациентов

При исследовании гена PRF1 выявлен один пациент - носитель двух мутаций:

ранее описанная миссенс-мутация c.916G>T (p.306Gly>Cys), приводящая к изменению аминокислотной последовательности в области MAC домена (Trizzino et al.,2008).
ранее не описанная нонсенс-мутация c.1283G>A (p.428 Trp>Stop), приводящая к образованию преждевременного стоп-кодона в области, кодирующей С2 домен белка.

Исследование всех экзонов и прилегающих областей экзон-интронных соединений гена UNC13D проведено в 25 образцах ДНК FHL пациентов.

При исследовании гена UNC13D найдено 13 мутаций в 13 семьях на 23 хромосомах. Выявлены 1 гомозиготный (GL17) и 9 компаунд-гетерозиготных носителей двух различных мутаций (GL1-5, 19, 27, 32, 33) в этом гене. Три пациента (GL8, GL15, GL18) оказались гетерозиготными носителями одной мутации в гене UNC13D.

Три мутации в гене UNC13D c.1828insA (на двух хромосомах), c.2346_2349del (на четырех хромосомах) и c.3037insG (на пяти хромосомах)) выявлены на одиннадцати хромосомах в группе российских FHL пациентов. Это составляет 48% всех хромосом с мутацией, найденных в гене UNC13D. Высокая суммарная частота выявляемости этих трех мутаций делает целесообразным использование системы с использованием ПЦР-ПДАФ для одновременной диагностики этих мутаций, в качестве первого этапа исследования выборки российских пациентов.

Из 13 мутаций в гене UNC13D, выявленных в результате проведенного исследования, 9 впервые описаны в данной работе (табл.1).

По две мутации в гене UNC13D найдены у 10 из 26 FHL пациентов. Доля FHL3 формы заболевания в исследованной группе составила 38%. Частота этой формы FHL в мире по литературным данным составляет от 17% в Германии (Zur Stadt U. et al., 2006) до 25% в Японии (Ishii E. et al., 2005)

Исследование гена STX11 проводилось в образцах ДНК 15 пациентов с неподтвержденным на первых этапах молекулярно-генетически FHL диагнозом. Выявлена одна ранее не описанная мутация c.675_679del во втором экзоне гена STX11 у пациента GL9 в гомозиготном состоянии. Обнаруженная мутация приводит к делеции трех аминокислот, вставке одной новой, исчезновению стоп-кодона и, предположительно, к образованию более длинной мРНК (p.H225_L227delinsHFsX127). Частота этой формы FHL сильно зависит от этнической принадлежности пациентов. Например, у курдов FHL4 выявляют у 20% пациентов, что связано с распространенностью в этой популяции нескольких мутаций, в других странах регистрируют единичные случаи FHL4 (Marsh R.A. et al., 2010).

Рис. 1 Регионы России, в которых проживают пациенты, составившие исследованную FHL группу
FHL4 форма диагностирована только у одного из обследованных пациентов, что соответствует международным данным о доле данной генетической формы заболевания в разных популяциях.

После первых трех этапов исследования диагноз не был подтвержден генетически 14-ти FHL пациентам. При исследовании кодирующих последовательностей гена RAB27A, ответственного за развитие синдрома Griscelli, не выявлено ни одной мутации. Согласно литературным данным до 10% пациентов с клиническим диагнозом FHL имеют мутации в гене RAB27A, что обусловлено тем, что нарушение пигментации у этих пациентов может быть очень незначительным (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=gene&part=hlh#hlh.Summary).Табл. 1. Мутации в гене UNC13D, выявленные в исследованной группе российских FHL пациентов (жирным шрифтом выделены мутации, впервые описанные в данной работе)

Выявленная мутация	Изменение аминокислотной последовательности	экзон / интрон	На скольких хромосомах выявлена	ссылка

c.919C>T	p.307Gln>Stop	экзон 11	1	новая

c.1055+5G>A	мутация сайта сплайсинга	интрон 12	1	новая

c.1592G>A	p.531Trp>Stop	экзон 18	1	новая

c.1828insA	p.R610HFsX6	экзон 20	2	новая

c.2216_2239del	p.N739_S747delinsS	экзон 23	2	новая

c.2867C>T	p.956Pro>Leu	экзон 30	1	новая

c.3011T>C	p.1004Asp>Gly	экзон 31	1	новая

c.3037insG	p.D1013GFsX11	экзон 31	5	новая

c.3173T>C	p.1058Leu>Pro	экзон 32	1	новая

с.2346_2349del	p.R782SFs11	экзон 24	4	E Rudd et al 2008

c.627delT	p.T209TFsX40	экзон 8	1	E Rudd et al 2008

c.322-1G>A	мутация сайта сплайсинга	интрон 4	1	Santoro et al 2006

c.2782C>T	p.928Arg>Cys	экзон 29	2	E Rudd et al 2008

После первых четырех этапов исследования диагноз остался не подтвержденным молекулярно-генетически у 14 пациентов. В образцах ДНК этих больных проведен поиск мутаций в гене STXBP2, ответственном за развитие FHL5 формы заболевания. Мутации в этом гене в исследованной FHL группе не выявлены, хотя по литературным данным эта форма заболевания встречается у 16% FHL пациентов в центральной Европе (Johnson J. et al., 2010; Zur Stadt U. et al., 2009).

Из 14 пациентов с неподтвержденным молекулярно-генетическим диагнозом FHL отобраны 10 мальчиков, семейный анамнез которых не позволял исключить Х-сцепленный тип наследования. При исследовании кодирующей последовательности гена SH2D1A обнаружены две мутации c.164G>T (p.55Arg>Leu) CD014961 (Dutz J.P. et al., 2001) у пациента GL14 и c.245_246insA (p.N82KFsX21) CI034488 у пациента GL34. Данные мутации приводят к развитию XLP согласно базе HGMD ( http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=SH2D1A). Таким образом, в группе FHL пациентов выявлено два мальчика с Х-сцепленным лимфопролиферативным синдромом. Зарубежные исследователи первичных гистиоцитозов подчеркивают возможную клиническую неразличимость FHL и XLP и рекомендуют всем мальчикам с диагнозом, неподтвержденным при исследовании FHL генов, обязательно проводить поиск мутаций в генах SH2D1A и BIRC4, ответственных за развитие XLP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book =gene&part=hlh#hlh.Summary). В исследованной FHL группе мутации в гене SH2D1A обнаружены у 2 пациентов из 26 обследованных. При исследовании данной группы пациентов в гене BIRC4 мутации не выявлены.

Исследование кодирующей последовательности генов SH2D1A и BIRC4 в группе XLP пациентов

При исследовании образцов ДНК 11 пациентов XLP группы у шести пациентов (D1, 2, 19, 20, 21 и 24) выявлены мутации в кодирующей последовательности гена SH2D1A.

У пациента D1 обнаружена делеция всего гена. Три пациента (D2, 19 и 20) оказались носителями нонсенс-мутации с.163С>T (p.55Arg>Stop) CD981809 (Coffey A.J. et al., 1998) в гемизиготном состоянии. Также в этом же кодоне выявлена мутация c.164G>T (p.55Arg>Leu) CD014961 (Dutz J.P. et al., 2001) у пациента из FHL группы. Возможно, в области кодона 55 расположена «горячая точка» мутаций гена SH2D1A.

Обнаружены две ранее не описанные мутации в гене SH2D1A. У 8- летнего мальчика с В-клеточной лимфомой и лимфоидным васкулитом выявлена инсерция c.53insA, приводящая к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного стоп-кодона (p.KK18KFs49). 13-летний мальчик с фульминантным инфекционным мононуклеозом оказался носителем дупликации восьми нуклеотидов c.257_264dupCATTTCAG, которая проявляется в инсерции трех аминокислот, сдвиге рамки считывания и образовании преждевременного стоп-кодона.

По литературным данным мутации в гене SH2D1A находят у 16-60% XLP пациентов (Filipovich A.H. et al., 2010; Sumegi J. et al., 2000). По-видимому, разница частоты выявляемости мутаций в гене SH2D1A обусловлена разными клиническими критериями отбора XLP пациентов в исследованные группы.

В нашей работе мутации в гене SH2D1A выявлены у 54% обследованных российских XLP пациентов, что хорошо соотносится с литературными данными.

При исследовании кодирующей последовательности гена BIRC4 мутации не обнаружены в XLP группе пациентов. А по литературным данным мутации гена BIRC4 выявляют в среднем у 20% XLP пациентов (Rigaud S. et al., 2006).

Разработка метода выявления наиболее частых мутаций в гене UNC13D

В ходе исследования кодирующей последовательности гена UNC13D в группе российских больных встретились повторяющиеся мутации. Инсерция c.1828insA выявлена на двух хромосомах, делеция c.2216-2239del – на двух хромосомах, делеция c.2346_2349del – на четырех хромосомах, инсерция c.3037insG – на пяти хромосомах. Эти три мутации (c.1828insA, c.2346_2349del, c.3037insG) составили 48% от хромосом с мутацией, выявленных в гене UNC13D. Эти три мутации обнаружены у 9 FHL пациентов, что составляет 34% от всех обследованных больных и 69% от пациентов с мутациями в гене UNC13D. Были выбраны праймеры и подобраны условия для проведения мультиплексной амплификации, позволяющей регистрировать 3 наиболее частые мутации. Результаты представлены на рис. 2.

Данный метод обладает высокой степенью информативности, исследование продолжается не более двух дней, не требует использования дорогих реактивов и сложных методических подходов. Таким образом, разработан простой, быстрый и недорогой метод диагностики наиболее частых мутаций гена UNC13D.