2.3 Определение активности ДАО и ПАО
Диаминоксидаза – диамин: кислород – оксидоредуктаза (дезаминирующая, пиридоксальфосфатсодержащая, КФ 1.4.3.6.) – окисляет субстраты с поглощением кислорода и образованием аммиака, перекиси водорода и соответствующего альдегида:
H2N(CH2)4NH2 + H2O + O2 → H2N(CH2)3CHO + H2O2 + NH3
Путресцин ДАО
При окислительном дезаминировании ПА также образуются лабильные иминоальдегиды, аммиак и перекись водорода:
H2N(CH2)3NH(CH2)4NH2 + 2O2 + 2H2O → OHC(CH2)2NH(CH2)3CHO
Спермидин ПАО Иминоальдегид +2H2O2 + 2NH3
H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2 + 2O2 + 2H2O2 →
Спермин ПАО
OHC(CH2)2NH(CH2)4NH(CH2)2CHO + 2H2O2 + 2NH3
Иминоальдегид
Известные методы, основанные на прямом определении поглощения кислорода и освобождения аммиака, микротитровании перекиси водорода, определении убыли субстрата в процессе реакции, требуют большого количества биоматериала, длительного периода инкубации и показывают относительно низкую чувствительность.
Для определения скорости окислительного дезаминирования ди- и полиаминов из большого числа различных методов в качестве прототипа выбрали спектрофотометрический метод измерения активности гистидазы в плазме крови кролика в модификации Gordon и Peters (1967) [9]. В основе метода лежит измерение окрашенного продукта, который образуется при окислении о-дианизидина перекисью водорода, образующейся в аминоксидазной реакции.
Катализатором о-дианизидиновой реакции служила пероксидаза. Провели замену о-дианизидиного основания на его гидрохлоридное производное. Это позволило использовать данный краситель не в спиртовом, а в водном растворе:
Существенное преимущество данного метода перед уже известными, заключалось в удалении из реакционной среды перекиси водорода и аммиака – сильных, неконкурентных ингибиторов окислительного дезаминирования. Нижняя граница чувствительности метода составила ± 0,1 нмоль и воспроизводимости ± 0,1 нмоль.
В качестве источника фермента использовался супернатант гомогената, полученный центрифугированием при 15000 об/мин в течение 20 мин (L7-55 Ultracentrifuge “Beckman”). Активность ДАО (амин: кислородоксидоредукта-за, дезаминирующая, пиридоксальсодержащая, КФ 1.4.3.6) и ПАО определялась спектрофотометрическим микрометодом [9] (таблица 8). В качестве субстрата использовался путресцин-2НС1, спермидин-3HCI и спермин-4HCI,полученные нами из свободных ПА фирмы «Fluka» (Швейцария).
За единицу активности принимали преобразование 1 нмоля субстрата, окисленного за 1 ч при 37°С. Удельную активность фермента выражали в единицах активности на 1 мг белка.
Таблица 8 - Общая схема определения аминооксидазной активности
2.4 Определение активности ОДК и уровней полиаминов
Совместное определение активности ключевого фермента синтеза полиаминов – ОДК и уровней полиаминов проводилось методом ВЭЖХ. Предварительный этап анализа по данным показателям заключался в следующем. Реакционная среда в 0,5 мл конечного объема содержала орнитин («Реахим»,Россия) в концентрации 80 мМ, пиридоксальфосфат («Реанал», Венгрия) –4 мМ, дитиотриэтол (“Serva”, ФРГ) 20 мМ в 50 мМ фосфатном буфере рН 6,6. В реакционную среду добавлялись тестируемые вещества до конечной концентрации 0,1 мМ и 0,3 мл супернатанта 33% гомогената гепатомы Г-27 или регенерирующей печени. Инкубация с веществами длилась 1 час при температуре 37 0С. Затем реакция останавливалась добавлением 0,1 мл 0,2 М раствора хлорной кислоты. Осадок отделяли центрифугированием при 6000 об./мин. в течение 5 минут. Для дальнейшего исследования использовалась надосадочная жидкость. Полученные таким образом пробы, хранились при температуре около 0 0С. Дальнейшие операции были связаны с подготовкой проб к определению концентрации полиаминов и активности ОДК методом ВЭЖХ. Для этого сначала проводилось бензоилирование проб. Бензоилирующим агентом был бензоилхлорид. Реакцию можно представить в виде следующей схемы:
NH2-R-NH2 + C6H5COCl C6H5CONH-R-NHCOC6H5 + 2HCl
Полиамин Бензоилхлорид
R= CH2 CH2 CH2 CH2 путресцин
CH2 CH2 CH2NH CH2 CH2 CH2 CH2 спермидин
CH2 CH2 CH2NH CH2 CH2 CH2 CH2 NH CH2 CH2 CH2 спермин
В полученные ранее пробы добавлялся 2N раствор NaOH, смесь интенсивно перемешивали в течение 1 минуты. Затем добавляли бензоилхлорид и вновь активно перемешивали в течение 2 минут. Полученную смесь выдерживали в условиях комнатной температуры в течение 1-2 часов. Реакция прекращалась добавлением NaCl. Образовавшиеся бензоильные производные полиаминов экстрагировали шестью порциями этилового эфира по 30 мл.Эфирные экстракты объединяли, эфир выпаривали досуха. Бензоильные производные полиаминов помещали в полиэтиленовые эппендорфы. Далее проводилось определение концентрации бензоилированных производных полиаминов методом ВЭЖХ на приборе «Милихром 5-3». Исходный метод определения количественного содержания полиаминов в биологических тканях с применением в качестве элюента для градиентного элюирования смеси метанол – вода был модифицирован Сяткиным С.П. и Голомазовой К.А. [7]. В отличие от исходного метода ВЭЖХ, где в качестве элюента использовался токсичный метанол, в данной модификации использовалась система ацетонитрил-вода. Это позволило снизить токсичность метода. Определение проводилось в режиме градиентного элюирования, при этом содержание ацетонитрила менялось от 10% до 100%, всего было 4 ступеней (0-10% ацетонитрила, 10-50% ацетонитрила, 50-80% ацетонитрила и 80-100% ацетонитрила). При определении использовалась колонка с обращенной фазой С18. Длина волны составляла 254 нм. Скорость потока 80 мкл/мин. Общее время анализа 1 пробы составляло около 17 минут. В таблице 10 представлен режим градиентного элюирования смесью ацетонитрила и воды. Все режимы элюирования и объемные отношения смеси были подобраны нами заново.
Таблица 9 - Режим градиетного элюирования смесью ацетонитрила и воды.
Время
|
Концентрация ацетонитрила в воде
|
Объем ступени, мкл
|
0-1 мин.
|
10 %
|
100
|
1-4 мин.
|
10-50 %
|
240
|
4-9 мин
|
50-80%
|
400
|
9-17 мин
|
80-100 %
|
640
|
Примечание - объемы ступеней указаны без объема регенерации и объемов буферов 1 и 2.
Объем регенерации колонки составлял 300 мкл, что учитывалось при составлении программы элюирования (закладывалось в программу при задании объма последней по порядку набора ступени элюирования), объем буфера 1 и буфера 2-0,5 мкл, объем вводимой пробы – 0,2 мкл. Расчет концентраций бензоильных производных полиаминов производился исходя из концентрации стандартных растворов бензоильных производных полиаминов. Стандартные бензоильные производные полиаминов получали самостоятельно, проводя реакцию бензоилирования стандартных субстанций полиаминов по указанной выше методике. Контроль качества полученных веществ (по показателям состав и количественный выход) проводился с помощью метода хромато-масс-спектрометрии. На рисунке 20, приведен хромато-масс-спектр стандартных производных полиаминов (время бензоилирования 2 часа).
Рисунок 20 - Хромато-масс-спектр бензоильных производных полиаминов (стандарт)
Далее проводилась ВЭЖХ стандартных производных полиаминов, при этом отмечались их времена удерживания и концентрации исходя из площадей их пиков. Определение проводилось при длине волны 254 нм.
Рисунок 21 - Хроматограмма, полученная методом ВЭЖХ на приборе «Милихром 5-3», стандартных производных полиаминов.
Рисунок 22 - Хроматограмма стандартных бензоильных производных
полиаминов, полученная методом ВЭЖХ.
Рисунок 23 - Указаны времена выхода бензоильных производных полиаминов в минутах.
Пики 1, 2 и 3 – это, соответственно, пики производных путресцина, спермидина и спермина. Затем проводилась ВЭЖХ анализируемых образцов и рассчитывались их концентрации в пробе. По концентрациям производных полиаминов расчитывалась удельная активность ОДК в анализируемых образцах.
|
