Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «башкирский государственный аграрный университет» современные основы рационализации

ВЫЯВЛЕНИЕ МИКОПЛАЗМЕННОЙ ИНФЕКЦИИ У ЛОШАДЕЙ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В.П. Терлецкий, А.А. Крутикова, Е.В. Никиткина, Д.О. Доронин, В.И. Тыщенко ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных, г. Санкт-Петербург-Пушкин Снижение репродуктивных качеств у животных, в том числе лошадей, сейчас становится все более актуальной проблемой. Связано это с тем, что у племенных животных значительные ресурсы организма отвлекаются на формирование селектируемых признаков, в то время как защитные свойства иммунной системы ослабляются. Условно-патогенные микроорганизмы получают шанс не просто на выживание, но и на активный рост, который сопровождается накоплением продуктов их жизнедеятельности. Эти продукты вместе с бактериальными токсинами изменяют свойства слизистых оболочек половых путей, что сказывается на репродуктивных качествах животных. Вступая в синергические отношения с вирусной, бактериальной и условно-патогенной микрофлорой, микоплазмы создают условия для ее активного роста и развития, что усиливает тяжесть течения данного заболевания [1,2,3]. Особенностью организма микоплазм является чрезвычайно малый физический размер (до 1 микрометра) и малый размер генома [4]. Биологические свойства микроорганизмов, обитающих в половых путях таковы, что инфекцию трудно выявить на ранних стадиях заболевания, в связи с тем, что она протекает бессимптомно. Даже в случае появления симптомов, доказать природу вызывающих их патогенов классическими методами крайне затруднительно, так как многие инфекции протекают со сходными симптомами. Ранние сроки выявления возбудителя означают более высокую эффективность лечения. Молекулярно-генетический метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), в отличие от многих других методов, способен выявлять ничтожно малое число бактериальных клеток (несколько десятков микробных клеток в 1 мл биологического материала) на ранних сроках развития инфекции. Своевременное выявление животных-носителей инфекции позволяет более эффективно проводить лечебные и профилактические мероприятия, направленные на повышении репродуктивной функции у животных и лечения бесплодия. Данный метод хорошо зарекомендовал себя в медицине. В последние годы метод ПЦР, включая ПЦР в реальном времени (real-time PCR) активно начинает использоваться и в ветеринарной практике [5]. За рубежом метод ПЦР давно уже стал стандартным в практике животноводства. Цель исследования состояла в выяснении распространенности микоплазменной инфекции в группе лошадей. Исследуемый материал отбирали у племенных лошадей ФХ Маланичевых и ООО «Ковбой». Слизь из половых путей самок собирали в пробирки и замораживали до использования. ДНК выделяли согласно инструкции к набору «Мик-Ком» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. В пробирки с лизирующим раствором вносим 100 мкл пробы. Образец тщательно перемешиваем на вортексе и прогреваем 5 мин при температуре 65˚С. Центрифугируем 5 секунд при 5000 об/мин на микроцентрифуге. В каждую пробирку затем вносим 25 мкл универсального сорбента. Перемешиваем на вортексе, оставляем инкубироваться 2 минуты, затем еще раз перемешиваем на вортексе, инкубируем дополнительно 5 минут. Осаждаем сорбент центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 секунд. Удаляем надосадочную жидкость, затем вносим по 300 мкл раствора для отмывки №1. Перемешиваем на вортексе, осаждаем сорбент центрифугированием, удаляем надосадочную жидкость. Вносим 500 мкл раствора для отмывки №2, перемешиваем на вортексе, центрифугируем, удаляем надосадочную жидкость. Повторяем процедуру отмывки с использованием раствора для отмывки №2. Подсушиваем сорбент универсальный после удаления надосадочной жидкости в термостате при 65˚ градусах по Цельсию в течение 5-10 минут. В пробирки вносим по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешиваем на вортексе, инкубируем в термостате при 65˚С в течение 5 минут с периодическим встряхиванием. При этом ДНК отделяется от сорбирующих шариков и переходит в раствор. Центрифугируем пробирки на максимальных оборотах микроцентрифуги в течение 1 минуты. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК, которая в последующем используется в реакции ПЦР. 1 2 3 4 5 6 7 М 8 9 10 11 12 13 М 14 15 ПК 509 п.о. Рисунок 1 Электрофореграмма продуктов полимеразной цепной реакции на выявление носительства микоплазменной инфекции у 15 лошадей ФХ «Маланичевых» (1- Бессарабия, 2-Альянс, 3-Баллада, 4-Дельба, 5-Варвара, 6-Румба, 7-Графита, 8-Улыбка) и ООО «Ковбой» (9-Пихта, 10-Дзинтари, 11-Капля, 12-Малахия, 13-Лия, 14-Хибара, 15-Лолита). ПК – положительный контроль. М – маркер. Наличие полосы на уровне полосы у положительного контроля (509 пар оснований ДНК, указано стрелкой) означает присутствие микоплазменной ДНК в образце ПЦР проводим в объеме 25 мкл. Используя прилагаемые к набору «Мик-Ком» пробирки, вносим на поверхность воска 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue. Сверху прибавляем 1 каплю стерильного минерального масла. Затем вносим по 10 мкл выделенной ДНК и ставим пробирки вместе с положительным и отрицательным контролями в термоциклер. Условия проведения ПЦР описаны в инструкции к набору. После окончания ПЦР пробы отбирались из нижней фазы и вносились в лунки 2% агарозного геля, содержащего флуоресцентный краситель бромистый этидий. Выявление продуктов амплификации проводили после 30 минутного электрофореза при напряжении 150 вольт (Рисунок 1). Ранее нами было проведено тестирование 30 голов коров из племенных хозяйств Ленинградской области, которое показало наличие микоплазм во всех образцах. В отличие от коров, микоплазменная инфекция была выявлена не у всех лошадей. Не обнаружена микоплазма у кобылы, которая ни разу не была в случке и искусственном осеменении, и у трех кобыл, регулярно приносящих жеребят. Почти все кобылы, у которых выявлена микоплазма, имеют проблемы с воспроизводством: низкая зажеребляемость, особенно у кобыл Дзинтари и Бессарабии, у Хибары – аборт на позднем сроке жеребости, у Пихты – эндометрит. Исключение составляет только Румба, которая регулярно приносит жеребят. Скорое всего это связано с хорошим иммунитетом этой кобылы, который подавляет микоплазму. Микоплазмоз может быть одной из причин низкого уровня воспроизводства у лошадей. Таким образом, молекулярно-генетический метод выявления микоплазменной инфекции позволяет достоверно выявить инфицированных животных. На примере лошадей прослеживается четкая связь между микоплазмозом и репродуктивными качествами кобыл. Литература: Прозоровский, С.В.и др. Персистенция микоплазм в инфицированном организме: наблюдения, причины и механизмы, диагностика. [Текст]:// ЖМЭИ.-1997.-№4.-С. 47-51. Андреев, Е.В. Смешанная вирусомикоплазменная инфекция [Текст] / Е.В.Андреев,П.П/ Фукс //Ветеринария.- 1980.- №8.-C. 30 -32. Шкиль, Н. Н. Эпизоотологические и иммунологические аспекты микоплазмоза телят во взаимосвязи с бруцеллезом и другими инфекциями [Текст]: Автореф. дис…. канд. ветеринар. Наук. - Новосибирск, 2000.- 23 с. Маркина, О.С. Сравнительное изучение геномов микоплазм, инфицирующих рогатый скот [Текст]: Автореф. дис…. канд. ветеринар. наук.// Казань, 1995. -22 с. Bashiruddin, J.B., Frey J., Konigsson M.N. Evaluation of PCR systems for the identification and differentiation of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis: a collaborative trial // Vet. J.- 2005.-v. 169.-P. 268-343. УДК 636.1.082.2 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ В СЕЛЕКЦИИ ЛОШАДЕЙ д.с.-х.н. Л.А. Храброва ГНУ ВНИИ коневодства Россельхозакадемии, г.Рязань Современные генетические подходы к совершенствованию пород основаны на более полной оценке генотипа животных и генетического разнообразия популяций с помощью разных маркерных технологий, включая контроль происхождения, маркер-вспомогательную селекцию и интрогрессию (межвидовой перенос генов). Использование маркерных генов для генетической экспертизы происхождения лошадей уже вошло в практику коннозаводства многих стран и стало обязательным элементом племенной работы с заводскими породами лошадей [1]. На сегодня наиболее актуальной задачей является изучение возможностей использования маркер-вспомогательной селекции и внедрения результатов научных исследований в коневодческую практику. Благодаря успешному завершению международного проекта по изучению генома лошади, уже изучена структура всех хромосом и известна локализация многих сотен генов, участвующих в сложных биохимических реакциях. С помощью ДНК-технологий были выявлены мутантные гены, вызывающие у лошадей серьезные наследственные заболевания, такие как саркомы, комбинированный иммунодефицит (SCID), церебральная атрофия (СА), гиперкалиемический паралич (HYPP) и многие другие. Общее число определяемых у лошадей маркерных генов уже превысило несколько десятков, что позволяет надежно контролировать значительную часть ее генома. Более того, систематическое тестирование всего поголовья лошадей заводских и местных пород создает реальную основу для внедрения генетического мониторинга и других методов маркерной селекции в практику коневодства. Связь между аллельными генами и селекционируемыми признаками животных теоретически возможна через разные генетические механизмы, включая детерминацию структурных генов и их плейотропное действие на формирование хозяйственно-полезных признаков. Данные модельного анализа свидетельствуют, что отбор животных по генетическим маркерам эффективен даже при отсутствии плейотропии и сцепления. Такие корреляции могут быть постоянными в ряде поколений, если они поддерживаются отбором, подбором и закрепляются инбридингом. В любом случае даже временные связи маркерных генов с хозяйственно-полезными признаками могут быть использованы в племенной работе с конкретными популяциями животных. Важным следствием открытия полиморфизма структурных генов и ДНК у сельскохозяйственных животных, в том числе лошадей, явилась возможность оценки степени гетерозиготности как конкретной особи, так и родственной группы животных и каждой популяции. Это очень важно для практической селекции, так как, при интенсивной селекции такие признаки, как работоспособность, крепость конституции, приспособленность, выраженность типа и экстерьера фенотипически проявляются при достаточно высоком уровне гетерозиготности. Сохранение большого количества аллелей даже у малочисленных пород указывает на существование механизмов, препятствующих сужению генетической изменчивости [3,4]. Обобщение литературных данных и результатов собственных исследований по изучению и использованию полиморфизма систем крови и ДНК лошадей, проведенных у нас в стране и за рубежом, показывает, что основными направления использования маркерной селекции в коневодстве являются следующие: Изучение генетической структуры пород и популяций лошадей, включая оценку степени биоразнообразия и других популяционных характеристик; Оценка степени генетических различий, изучение происхождения и микроэволюции пород; Проведение генетического мониторинга в породах лошадей, сохранение оригинальности и гетерогенности аллелофонда малочисленных пород; Совершенствование метода линейного разведения. Генетическая оценка степени дифференциации генеалогической структуры породы, определение генетического сходства с родоначальником линии; Контроль использования родственного разведения, включая мониторинг за нарастанием гомозиготности и оценку результатов инбридинга; Селекция лошадей по маркерам, определяющими хозяйственно-полезные признаки; Диагностика наследственных дефектов и заболеваний, в том числе SCID, СА, LES, HYPP и др. Систематическое тестирование лошадей в РФ позволяет не только проводить генетическую экспертизу происхождения, но и дает возможность селекционерам использовать имеющуюся информацию о типах полиморфных систем крови и микросателлитах ДНК в качестве маркеров генотипа животных при решении всех задач теоретической и практической селекции. В настоящее время Государственный реестр селекционных достижений включает 44 породы и 5 типов лошадей, и практически все из них прошли генетическую паспортизацию во ВНИИ коневодства. Оказалось, что практически все изученные породы имеют своеобразный аллелофонд, отражающий происхождение, направление их хозяйственного использования и степень генетического родства. Общепризнанно, что степень разнообразия полиморфных генов в настоящее время является объективным и информативным критерием оценки генетической изменчивости и самобытности популяций и пород. При изучении молекулярно-генетических характеристик разных пород лошадей было установлено, что каждая из них имеет особую генетическую структуру. Кластерный анализ выявил, что изученные породы четко подразделяются на два субкластера, в один из которых входят только заводские, а во второй – преимущественно местные породы лошадей. Генетический мониторинг в коневодстве особенно актуален в связи с небольшой численностью племенного поголовья многих отечественных пород, включая буденовскую, владимирскую, донскую, терскую и др. Он дает возможность дополнить традиционную селекцию новыми технологиями и позволяет вести отбор и подбор не только на фенотипическом, но и на генотипическом уровне. Одна из основных задач генетического мониторинга - это поддержание в породах генетического разнообразия, что является необходимым условием для творческой селекционной работы [2]. Мониторинг аллелофонда 6 заводских пород показал, что динамика генетических процессов в группах жеребцов и маток не всегда имеет однонаправленный характер. В целом в течение последних десятилетий у жеребцов-производителей пяти заводских пород шел процесс снижения генетического разнообразия и элиминации редких аллелей. Это привело к тому, что в настоящее время у продуцирующих жеребцов верховых и рысистых пород (за исключением орловского рысака) преобладают одни и те же типы белков: TfFF, TfDF, EsII и аллели Ddk и Dcgm. Современные методы изучения ДНК обусловили реальную возможность системного поиска генов и участков хромосом, определяющих скаковую работоспособность лошадей. Недавно было установлено, что на скаковую карьеру и дистанционные способности лошадей оказывает влияние структура гена миостатина (MSTN), локализованного в 18-й хромосоме. Для лошадей уже разработаны генетические чипы, позволяющие одновременно проводить ДНК-типирование нескольких десятков важных генов, что создает реальную основу для внедрения методов маркерной селекции и геномной оценки в коневодстве. Литература: 1. Дубровская, Р.М. Методические рекомендации по использованию полиморфных систем белков и групп крови при контроле достоверности происхождения лошадей [Текст]/Р.М.Дубровская / ВНИИ коневодства, 1986. - 39с. 2. Храброва, Л.А. Методические рекомендации по ведению генетического мониторинга местных пород лошадей [Текст] /Л.А. Храброва и др./ Дивово, 2005, - 50 С. 3. Храброва, Л.А. Руководство по использованию микросателлитов ДНК при генотипической оценке лошадей [Текст]/Л.А. Храброва, Н.В. Блохина/ Дивово, 2012, - 20с. 4. Храброва, Л.А. Метод оценки генетического разнообразия и степени генотипического сходства лошадей заводских и местных пород [Текст]/Л.А. Храброва и др. – Дивово, 2011. – 25 с. УДК 638.12 ЗАВИСИМОСТЬ КАТАЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ РЕКТАЛЬНЫХ ЖЕЛЕЗ У МЕДОНОСНЫХ ПЧЕЛ ОТ ДЛИНЫ И ВЕСА ПРЯМОЙ КИШКИ. Н.М. Абдулгазина, А.Б. Сафаргалин, Ф.Г. Юмагужин ФГБОУ ВПО Башкирский государственный агарный университет (Зауральский филиал), г. Сибай Важнейшим признаком медоносных пчел в условиях продолжительной зимы является – зимостойкость. Зимостойкость – это сложное биологическое явление, определить которое по одному какому-нибудь значению невозможно. В связи с этим важным является установление косвенных значений зимостойкости пчел, по которым ее можно было бы прогнозировать. Следует отметить, что результаты зимовки пчел зависят от различных факторов: степени подготовленности пчел к зиме, качества корма, условий зимовки. Но в основном под зимостойкостью понимается способность пчел длительное время противодействовать гнилостным процессам в прямой кишке и не опонашиваться [1]. А это напрямую зависит от активности каталазы ректальных желез. Каталаза - это фермент класса оксиредуктаз, катализирует разложение перекиси водорода до воды и кислорода, является одним из основных ферментов разрушения активных форм кислорода. Атомарный кислород, который получается при окислении перекиси водорода, препятствует развитию гнилостных микроорганизмов. Итак, активность каталазы ректальных желез является важным показателем интенсивности обмена веществ и является важным адаптационным механизмом зимостойкости медоносных пчел [2]. Нами рассматривались различия уровня активности каталазы ректальных желез от сезона года, связь активности каталазы с длиной прямой кишки, ее весом и значением кубитального индекса у местных медоносных пчел в горно-лесной и степной зонах Зауралья Республики Башкортостан. Сравнивали результаты с идентичными данными, полученными с бортевых пчелиных семей бурзянской популяции заповедника «Шульган-Таш» и заказника «Алтын Солок». Исследования проводились в 2009 – 2011 годах. Пробы пчел для анализа отбирали по 20-25 штук. В каждой группе исследовали по 20 пчелиных семей. Анализ активности фермента проводили перманганатометрическим методом, данные выражали в единицах мкмоль/мин/мг. Зависимость активности каталазы ректальных желез от длины и веса прямой кишки в весенний период представлена в таблице 1. Длина и вес прямой кишки напрямую зависят от его наполненности каловыми массами. Из таблицы 1. видно, что с увеличением длины прямой кишки не происходит пропорциональное увеличение ее веса. К примеру, в 2009 году у пчелиных семей с бортей при длине прямой кишки 8,2 мм, вес ее составил 0,86 мг, 2010 году 8,45 мм и 0,39 мг, а 2011 году 7,65 мм и 0,63 мг, соответственно. Таблица 1 Зависимость активности каталазы ректальных желез от длины и веса прямой кишки (выборки пчел весенней генерации) Годы Выборки пчелиных семей Длина прямой кишки, мм Вес, мг Активность каталазы 2009 бортевые 8,2 0,86 34,50 горно-лесные 8,17 0,29 48,13 степные 8,04 0,36 49,26 2010 бортевые 8,45 0,39 45,50 горно-лесные 8,05 0,44 47,63 степные 8,22 0,91 20,29 2011 бортевые 7,65 0,63 40,25 горно-лесные 8,05 0,31 49,50 степные 7,75 0,91 133,83 У пчелиных семей с рамочных ульев с горно-лесной зоны в 2009 году данные значения составили 8,17 мм и 0,29 мг, 2010 году – 8,05 мм и 0,44 мг, a 2011 – 8,05 мм и 0,31 мг, соответственно. В выборках пчелиных семей со степной зоны также прямая зависимость длины прямой кишки от ее веса не проявляется. Если в 2009 году длина прямой кишки у медоносных пчел со степной зоны составил 8,04 мм, ее вес 0,36 мг, то 2010 году – 8,22 мм и 0,91 мг, а 2011 году – 7,75 мм и 0,91 мг, соответственно. В то же время следует подчеркнуть, что активность каталазы ректальных желез медоносных пчел различной выборки в пределах Зауралья Республики Башкортостан зависит от веса и длины прямой кишки. При этом выявляется отрицательные соотношения данных параметров. Наиболее информативно вышеизложенное мнение представлено на рисунках 1 и 2. Рисунок 1 Соотношение активности каталазы ректальных желез от длины прямой кишки (пчелы весенней генерации) Из рисунка 1 видно, что наименьшей активности каталазы ректальных желез приходится наибольшая длина кишечника у всех выборок пчел весенней генерации по соответствующим годам и наоборот. Лишь у выборок пчел со степной зоны в 2011 году наблюдается отрицательная тенденция. Видимо, это связано с начинающимися процессами брожения в прямой кишке. Как видно из рисунка 2 соотношение веса прямой кишки от каталазной активности ректальных желез также противоположное и наоборот. Это ярко видно у выборок медоносных пчел из бортей в 2009 году и со степной - в 2010 году. У выборок пчел с горно – лесной зоны зависимость сильно не проявляется. А у выборок пчел со степной зоны в 2011 году наибольшему весу прямой кишки соответствует высокая активность каталазы, что подтверждает мнение о процессах брожения, происходящих в прямой кишке. Рисунок 2 Соотношение активности каталазы ректальных желез от веса прямой кишки (пчелы весенней генерации) Для медоносных пчел осенней генерации вышеизложенное утверждение остается также верным, то есть наблюдается зависимость каталазной активности ректальных желез от длины и веса прямой кишки или наполненности ее каловыми массами. Таким образом, чем больше длина и вес прямой кишки, тем меньше каталазная активность ректальных желез и наоборот чем меньше длина и вес прямой кишки, тем больше активность данного фермента. То есть наполненность прямой кишки напрямую регулирует физиологические процессы выделения фермента каталазы. Литература Лебедев, В.И. Биология пчелы медоносной и пчелиной семьи [Текст] / В.И. Лебедев, Н.Г. Билаш. – М.: КолосС, - 2006. – С. 232 – 234. Жеребкин М.В. Зимовка пчел [Текст] / М.В.Жеребкин. – М.: Россельхозиздат, 1979. – 151 с. УДК 638.121.1 Новые технологии по замене пчелиных маток

Похожие:

	Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования		Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
	Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «орловский государственный...		Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
	Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования		Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
	Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования		Министерство сельского хозяйства РФ федеральное государственное бюджетное... Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
	Ставропольский государственный аграрный университет Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования		Ставропольский государственный аграрный университет Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
	Ставропольский государственный аграрный университет Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования		Ставропольский государственный аграрный университет Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
	Ставропольский государственный аграрный университет Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования		Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального... Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «орловский государственный аграрный...
	Ставропольский государственный аграрный университет утверждаю Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования		Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования