Связь противовоспалительной активности пектинов с их структурой

На правах рукописи Марков Павел Александрович СВЯЗЬ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПЕКТИНОВ С ИХ СТРУКТУРОЙ 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Сыктывкар - 2009 Работа выполнена в УРАН Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, г. Сыктывкар. Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Попов Сергей Владимирович. Научный консультант: академик РАН Оводов Юрий Семенович Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Офицеров Евгений Николаевич доктор биологических наук, профессор Чиков Владимир Иванович Ведущая организация: УРАН Институт физиологии и иммунологии УрО РАН, г. Екатеринбург. Защита состоится 26 марта 2009 г. в 13.00 на заседании диссертационного Совета Д 212.081.08. при Казанском государственном университете по адресу: 420008, г.Казань, ул. Кремлевская, д.18 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н.И.Лобачевского Казанского государственного университета Автореферат разослан «20» февраля 2009 г. Ученый секретарь диссертационного Совета доктор биологических наук, профессор З.И.Абрамова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Установлено, что пектины ингибируют развитие воспаления стенки кишки у экспериментальных животных, при этом противовоспалительное действие пектинов сопровождается уменьшением количества кишечных лейкоцитов (Rolandelli et al., 1988; Liu et al., 2003; Lim et al., 2003). Ранее показано, что пектины способны не только подавлять, но и стимулировать активность лейкоцитов. Так, например, лемнан LM, пектин из ряски малой Lemna minor L., и силенан SV, пектин из смолевки обыкновенной Silene vulgaris L., стимулируют функциональную активность лейкоцитов и оказывают провоспалительное действие (Попов, 2002, Popov et al., 2006). В то же время комаруман CP, пектин из сабельника болотного Comarum palustre L., и потамогетонан PN, пектин из рдеста плавающего Potamogeton natans L., обладают противовоспалительным действием (Popov et al., 2005, 2007). Приведенные примеры говорят о том, что реакция иммунной системы млекопитающих на пектины зависит от особенностей строения полисахаридов. Исследования противовоспалительного действия пектинов при повреждении кишечной стенки проводятся с использованием коммерческих пектинов, главным образом, цитрусового и яблочного (Koruda et al. 1986; Rolandelli et al., 1988; Mao et al., 1996), при этом не учитывается структурное разнообразие пектинов, встречающихся в природе. Макромолекула пектинов представляет собой сложный гетерополисахарид, содержащий линейные области α-D-галактуронана и разветвленные области, в состав которых, наряду с галактуроновой кислотой, входят остатки нейтральных моносахаридов (BeMiller, 1986; O’Neill et al., 1990). В основе макромолекулы всех пектиновых полисахаридов лежит линейная цепь из 1,4-связанных остатков α-D-галактопиранозилуроновой кислоты, образующих фрагменты линейного галактуронана (Schols, Voragen, 1996). Отдельные участки галактуронана связаны между собой остатками α-L-рамнопиранозы и образуют линейный рамногалактуронан, при этом на один остаток рамнозы может приходиться от 25 до 200 остатков α-D-галактуроновой кислоты (Powell et al., 1982; Thibault et al., 1993). Разветвленная область макромолекулы пектинов образована гетерогликаногалактуронанами: чаще всего рамногалактуронаном I (RG-I) и рамногалактуронаном II (RG-II), реже апиогалактуронаном и ксилогалактуронаном (Оводов, 1998). Известно, что макромолекула пектинов, выделенных из разных растений, различается структурой линейной и разветвленной области (Оводова и др., 2000-2006). Ранее было показано, что действие пектинов на воспаление зависит от строения линейной и разветвленной области их макромолекулы. Так, например, галактуронановый фрагмент макромолекулы комарумана CP ингибирует развитие воспаления (Popov et al., 2005), а апиогалактуронан, фрагмент разветвленной области макромолекулы лемнана LM, оказывает провоспалительное действие (Popov et al., 2006). Было установлено, что действие пектинов на функциональную активность лейкоцитов зависит от молекулярной массы пектиновой макромолекулы (Puhlmann et al., 1992). Установлено, что пектины, обладающие провоспалительным действием, имеют молекулярную массу свыше 100 кДа (Попов, 2002). В то же время показано, что фрагмент потамогетонана с молекулярной массой свыше 300 кДа оказывает противовоспалительное действие. Не исключено, что действие пектинов на воспаление связано с их молекулярной массой. Связь между особенностями строения макромолекулы пектинов и их действием на воспаление кишечника не исследована. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: выявить область макромолекулы пектинов, обусловливающую их противовоспалительную активность при кишечном воспалении у мышей. Задачи исследования. Выявить пектины, предотвращающие развитие воспаления в стенке толстой кишки у мышей. Исследовать противовоспалительную активность линейной области макромолекулы пектинов. Определить зависимость противовоспалительного действия пектинов от типа строения разветвленной области макромолекулы. Оценить действие на воспаление пектиновых фрагментов, различающихся по молекулярной массе и моносахаридному составу. Дать характеристику противовоспалительного действия пектинов при повреждении стенки толстой кишки у мышей, вызванного ректальным введением уксусной кислоты. Научная новизна работы. В работе впервые исследована способность различных по структуре пектинов ингибировать развитие воспаления в стенке толстой кишки у мышей. Выявлены новые пектины, оказывающие противовоспалительное действие при химическом повреждении стенки толстой кишки у мышей. Установлено, что участки галактуронана обладают противовоспалительным действием. Показано, что противовоспалительная активность пектинов не зависит от молекулярной массы фрагментов пектинов и от типа строения разветвленной области их макромолекулы. Впервые показано, что пектины с определенной структурой способны ингибировать развитие воспаления стенки кишки при однократном превентивном пероральном введении. Показано, что при этом снижается адгезия перитонеальных лейкоцитов и проницаемость стенки сосудов брюшной полости у мышей. Научно-практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы в технологии производства пектиновых препаратов с противовоспалительной активностью с перспективой их применения в качестве биологически активных добавок или лекарственных средств. Накопленные данные открывают возможность дать рекомендации об использовании растений, содержащих пектиновые полисахариды с изученным строением, в пищевой и фармакологической промышленности. Результаты диссертационной работы расширяют представление о связи между физиологической активностью пектинов и их строением и могут быть использованы в курсе лекций для студентов биологических, химических и медицинских факультетов. Основные положения, выносимые на защиту. Выявлено, что из пятнадцати исследованных пектинов (см. табл. 1, 2, стр. 6, 7) только комаруман СР, оксикоккусан ОР, пектин клюквы Vaccinium oxycoccus L., танацетан TVC, пектин пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare L., раувольфиан RS и RSP, пектин раувольфии змеевидной Rauwolfia serpentine L. предотвращают развитие кишечного воспаления. Установлено, что эти пектины способны ингибировать развитие воспаления в стенке толстой кишки у мышей при однократном превентивном пероральном введении. Противовоспалительное действие пектинов обусловлено галактуронановым фрагментом их макромолекулы. Галактуронан предотвращает повреждение стенки кишки независимо от противовоспалительной активности исходного пектина. Показано, что противовоспалительным действием обладают слаборазветвленные фрагменты пектинов, основным составляющим элементом которых является галактуронан. Противовоспалительным действием обладают только те пектины, которые блокируют привлечение нейтрофилов в стенку толстой кишки после ректального введения кислоты. Апробация работы. По результатам исследований были сделаны доклады на III Съезде биохимического общества (С.-Петербург, 2002); IV Молодежной научной конференции: «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2004); IX Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых: «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2005); VIII Всероссийском конгрессе: «Оптимальное питание – здоровье нации» (Москва, 2005); Международном научно-медицинском форуме «Гастро-2006» (С.-Петербург, 2006); IV Всероссийской научной конференции: «Химия и технология растительных веществ (Сыктывкар, 2006); II Международной научной конференции: «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Алматы, Казахстан, 2007). Публикации. По результатам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 101 машинописной странице, состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов и списка литературы (180 источников). Диссертация содержит 5 таблиц и 21 рисунок. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Пектины из растительного сырья выделяли по ранее описанной методике (патент РФ №2149642). При получении линейного фрагмента макромолекулы пектинов использовали метод частичного кислотного гидролиза. Для гидролиза применяли трифторуксусную кислоту, поскольку она вызывает наименьшую деструкцию моносахаридов (York et al., 1986). Данный метод основан на различной устойчивости гликозидных связей полисахаридов к действию кислот (Aspinall, 1982), что дает возможность получать из пектинов галактуронан, лишенный боковых углеводных цепей из остатков нейтральных моносахаридов (Thibault et al., 1993). Для получения гомогенных по молекулярной массе фракций пектинов проводили их последовательное разделение по молекулярной массе в ультрафильтрационной ячейке («Millipore», США) с помощью ультрафильтрационных мембран (полисульфон, «Владисарт», Россия) с различными размерами пор (300, 100 и 50 кДа). В результате были получены пектиновые фрагменты с молекулярными массами более 300 кДа, 100–300 кДа и 50–100 кДа. Пектины и их фрагменты, использованные в работе, были получены в лаборатории биотехнологии и лаборатории гликологии Отдела молекулярной иммунологии и биотехнологии Института физиологии Коми НЦ УрО РАН. Образцы полисахаридов и их структуроно-химическая характеристика получены и любезно предоставлены к.х.н. Оводовой Р.Г., к.х.н. Головченко В.В. и к.б.н. Гюнтер Е.А. Химическая характеристика исследованных пектинов представлена в Таблицах 1 и 2. Исследования проводили на самцах и самках половозрелых белых лабораторных мышей массой тела 25-30 г., полученных из специализированного питомника «Рапполово» (ФГУП, РАМН). Водные растворы полисахаридов вводили перорально, в дозах от 50 до 200 мг/кг однократно утром натощак. Контрольные животные получали эквивалентный объем воды. Повреждение стенки толстой кишки индуцировали через 48 часов путем разового ректального введения 5%-ой уксусной кислоты (100 мкл). Кислоту вводили через пластиковый катетер на глубину 3 см проксимальней ануса (Iton et al., 2000). В качестве сравнения использовали пектин яблочный и пектин цитрусовый (МР Biomedicals Inc.). Для положительного контроля использовали преднизолон. Через сутки после ректального введения кислоты мышей умерщвляли и изолировали фрагмент (5 см) толстой кишки проксимальней ануса. Определяли степень повреждения стенки толстой кишки (Mahgoub et al., 2003). Площадь поражения выражали в процентах от площади фрагмента кишки. Таблица 1 Общая химическая характеристика полисахаридов, использованных в работе Источник выделения Название GalA, % Нейтральные моносахариды, % Gal Ara Rha Api Glc Xyl Man Сабельник болотный Comarum palustre L., (наземная часть) Комаруман СР* 64,0 13,0 6,0 12,0 - - - - Комаруман СР Комаруман СРH* 96,0 3,5 - 1,5 - - - - Клюква четырехлистная Vaccinium oxycoccos L. (шрот ягод) Оксикоккусан ОР* 82,4 3,4 8,0 1,3 - 4,7 0,4 0,5 Брусника Vaccinium vitis-idaea L. (шрот ягод) VV* 81,6 3,0 4,5 2,1 - 3,3 0,5 0,4 Бадан толстолистный Bergenia crassifolia (листья) Бергенан BC* 84,0 3,1 2,8 1,3 - 2,0 0,24 1,1 Ряска малая Lemna minor (листья) Лемнан LM* 64,0 4,9 3,9 3,2 19,6 - 3,7 - Лемнан LM Лемнан LMH 98,9 - - - - - - - Смолевка обыкновенная Silene vulgaris L. (стебель, листья) Силенан SV* 63,0 3,2 4,2 2,2 - 2,7 1,9 1,1 Силенан SV Силенан SVH 94,7 сл. - сл. - - - - Каллус раувольфии змеевидной Rauwolfia serpentina Раувольфиан RS* 51,0 6,8 7,1 2,6 - 31,3 0,5 0,7 Раувольфиан RSP* 82,0 5,0 4,1 2,1 - 5,0 1,8 - Каллус пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare Танацетан TVС** 68,0 4,4 5,2 1,5 - 1,4 1,1 0,4 Танацетан TVС Танацетан TVС300** 77,0 2,3 4,1 1,0 - 0,8 0,4 0,2 Танацетан TVС Танацетан TVС50** 2,0 1,2 2,1 0,4 - 2,2 1,6 1,0 Танацетан TVС Танацетан TVCH 98,0 - - - - - - - Каллус ряски малой Lemna minor Лемнан LMС** 52,7 8,9 8,3 2,4 1,4 1,6 2,5 0,5 Лемнан LMС Лемнан LMС300** 69,6 4,4 10,5 0,5 1,0 0,4 1,1 0,2 Лемнан LMС Лемнан LMС50** 29,2 21,5 17,5 1,8 1,7 7,5 17,2 1,6 Лемнан LMС Лемнан LMСH 97,0 - - - - - - - Каллус смолевки татарской Silene tatarica Силенан STС** 68,6 4,0 2,8 1,5 - 1,8 1,7 1,1 Силенан STС Силенан STС300** 65,5 5,3 4,0 2,1 - 1,3 0,8 0,9 Силенан STС Силенан STС50** 33,4 8,8 4,8 2,1 - 10,3 10,3 3,8 продолжение Таблицы 1 Источник выделения Название GalA, % Нейтральные моносахариды, % Gal Ara Rha Api Glc Xyl Man Силенан STС Силенан STСH 98,0 - - - - - - - Пектин яблочный AP MP Biomedicals Inc. 70,0 сл. - сл. - 29,0 сл. - Пектин яблочный AP APH 99,0 - - - - - - - Пектин цитрусовый PC MP Biomedicals Inc. 67,0 3,1 1,2 1,7 - 27,0 0,6 - Примечание: GalA – галактуроновая кислота, Gal – галактоза, Ara – арабиноза, Rha – рамноза, Api – апиоза, Glc – глюкоза, Xyl – ксилоза, Man – манноза. * – пектины выделены и охарактеризованы в Лаборатории гликологии ИФ Коми НЦ УрО РАН. ** – пектины выделены и охарактеризованы в Лаборатории биотехнологии ИФ Коми НЦ УрО РАН. Таблица 2 Молекулярно-массовая характеристика пектиновых фрагментов Пектины Молекулярная масса пектиновых фрагментов, кДа Содержание фрагментов в пектине, % Комаруман СР 50-100 5,2 100-300 8,7 300-400 52,8 >400 33,1 Раувольфиан RS 100-300 99,8 Лемнан LM 50-100 38,9 100-300 57,6 >400 3,4 Танацетан TVC 50-100 7,6 >300 80,0 Лемнан LMC 50-100 7,6 >300 65,0 Силенан STC 50-100 3,3 >300 62,4 Зостеран ZM* >300 74.0 >400 24.5 Пектин яблочный AP >400 99,5 Пектин цитрусовый PC 100-300 77,0 >400 22,9 *Пектин морских трав сем. Zosteraceae: Zostera marina L. и др. О степени инфильтрации стенки толстой кишки нейтрофилами судили по активности миелопероксидазы (МПО) – специфического фермента азурофильных гранул нейтрофилов (Krawisz et al., 1984). Активность МПО в стенке кишки определяли спектрофотометрически по ранее описанной методике (Пинегин, 1995; Evans, 2000). Проницаемость стенки сосудов определяли в тесте с красителем Эванса (Bettina et al., 2000). Количество кишечной слизи в толстой кишке оценивали по степени связывания красителя алцианового синего со слизистой кишечника (Blandizzi et al., 1999). Определяли адгезию перитонеальных лейкоцитов у мышей (Fraser et al., 1993). При обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение, среднее квадратичное отклонение. Достоверность различий оценивалась по U-критерию Манна-Уитни, с использованием программного обеспечения “Statistica 6.0” (Stat Soft. Inc).

Похожие:

	Связь солнечной активности с Юпитером и Сатурном Предлагается новая версия связи солнечной активности с орбитами Юпитера и Сатурна		Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... «родственной» пенсионному фонду структурой, однако этот запрет легко обходится участниками рынка, поскольку структура владения нпф...
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цели: показать необходимость читательского труда; дать понятие о литературе как искусстве слова; показать связь литературы с другими...		Алкены ключевые слова: алкены, олефины, этиленовые углеводороды, двойная связь, σ-связь, π-связь Цель урока: Обобщение знаний по разделу «Профессиональное образование и самоопределение» в систему. Активизация процесса профессионального...
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Мы живем во времена бурного развития современной и массовой гиподинамии, когда ребенок волей – неволей становится заложником быстро...		Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Положительное влияние двигательной активности на растущий организм проявляется в улучшении работы сердечно-сосудистой и дыхательной...
	Урок в 8 классе по теме «Ковалентная связь» Ребята! Сегодня мы начинаем изучение новой темы «Химическая связь. Строение вещества»		Урок развития речи по картине Цель: показать связь произведений изобразительного искусства с изучаемым литературным материалом, научить искать между ними ассоциативную...
	1. Организационно методические указания Для России в настоящее время рост инновационной активности приобретает особое значение. Именно усиление инновационной активности...		Методические рекомендации по изучению дисциплины «Технологии развития... Цель освоения дисциплины «Технологии развития экономической активности: молодежное предпринимательство, карьера молодежи» формирование...
	Рабочая программа по предмету «Литература» 9 класс Рассмотрена на заседании мо Большое внимание уделяется развитию познавательной активности учащихся, формированию навыков самостоятельного приобретения знаний,...		Е. С. Пенчук 2009 г. Инновационный менеджмент рабочая программа Для России в настоящее время рост инновационной активности приобретает особое значение. Именно усиление инновационной активности...
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... «Ковалентная связь», таблица «Ионная связь», карточки с формулами простых и сложных веществ, основа сводной итоговой таблицы «Типы...		Реферат по дисциплине: «Радиотелефонные и сотовые коммуникационные системы» Спутниковая связь — один из радиосвязи, основанный на использовании искусственных спутников земли в качестве ретрансляторов. Спутниковая...
	Отчет о научно-исследовательской работе по теме: «Классификация действующих... «Классификация действующих нормативных документов РФ в соответствии с принятой структурой системы нормативных документов»		Изложение нового материала (тема, научность, метод изложения, доходчивость,... Изучение поурочного плана (технологической карты) – План урока поэтапный, содержит цели