Сэндвич-метод иммуноферментного определения hbsAg с помощью рн чувствительных сорбируемых моноклональных антител 14. 03. 09 клиническая иммунология, аллергология

Положения, выносимые на защиту 1. На основе полученной в работе панели МКА к HBsAg сконструирован сэндвич-метод определения HBsAg в сыворотке крови, обладающий высокой аналитической чувствительностью. Минимальная достоверно определяемая концентрация HBsAg в сыворотке крови для сконструированного метода составила 0,013 – 0,017 МЕ/мл 2. В ходе оптимизации адсорбции МКА на твердую фазу (полистироловые планшеты) были обнаружены антитела, биологическая активность которых сохранялась значительно лучше после иммобилизации при кислых значениях рН (2,8) по сравнению с сорбцией при рН 7,5 и 9,5. В случае МКА 18С8, обладавших наибольшей ацидофильностью, минимальная достоверно определяемая концентрация HBsAg уменьшалась в 7 – 10 раз. Использование МКА 18С8, адсорбированных при рН 2,8, позволило сконструировать вышеупомянутый сэндвич-метод. 3. Изменение рН адсорбции МКА не влияло на общую поверхностную концентрацию антител на поверхности иммунных планшетов. 4. Описанный в настоящей работе простой методический прием, который заключается в использовании буферных растворов с низким значением рН для адсорбции антител на полистироловую поверхность планшетов, может быть рекомендован для оптимизации как конкурентных, так и сэндвич-методов определения антигенов. Внедрение результатов работы в практику Материалы диссертации в 2011-12 гг. использовались в педагогическом процессе (лекциях и семинарских занятиях) кафедр вирусологии и эпидемиологии ГБОУ ДПО "Российская медицинская академия последипломного образования" Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию. Апробация работы Работа была доложена на международной конференции "Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями" (Санкт-Петербург, 2010 г.). По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, 2 из которых в журналах, рекомендуемых ВАК. Апробация диссертации состоялась 2 марта 2010 года на научной конференции отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе ФГБУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Материалы Три препарата HBsAg: антиген, очищенный из крови, рекомбинантный HBsAg серотипа adw и рекомбинантный антиген серотипа ayw были любезно предоставлены НПО "Диагностические системы". В работе использовали иммунные планшеты фирмы “Nunс”, рекомбинантный стрептавидин и стрептавидин-пероксидазу НПО "Диагностические системы". Конъюгаты МКА и аффинных кроличьих антител к IgG мыши с пероксидазой хрена готовили в лаборатории периодатным методом [Nakane and Kawaoi, 1974]. Методы Получение гибридом. Гибридомы получали по методу Келлера и Мильштейна [Koller and Milstein, 1975], используя технику слияния, принятую в лаборатории [Massino et al., 1992]. Культуральную среду от каждой выросшей гибридомы тестировали на наличие антител к HBsAg твердофазным иммуноферментным методом (ИФА). Положительные гибридомы клонировали методом лимитирующих разведений, используя в качестве питающего слоя мышиные перитонеальные клетки. Определение антигенсвязывающей активности антител. Для определения антигенсвязывающей активности антител иммунные планшеты насыщали HBsAg в течение ночи при комнатной температуре (1 мкг/мл в 0,05 М Na-фосфатном буфере рН 7,5; 100 мкл раствора на лунку). Прочие процедуры твердофазного ИФА описаны ранее [Nikulina et al., 2000]. Очистка антител. МКА очищали из асцитной жидкости с помощью ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефарозе, как описано ранее [Massino et al., 1997]. Фракции пиков объединяли и определяли антигенсвязывающую активность антител, как описано выше. Определение концентрации антител. Концентрацию очищенных иммуноглобулинов определяли оптическим методом, полагая, что для однопроцентного раствора мышиных антител=14 [Fasman, 1976]; для однопроцентного раствора очищенной пероксидазы =22,75 и =7,3 [Ishikawa et al., 1983]; для рекомбинантных HBsAg =0,33. Приготовление конъюгатов. МКА конъюгировали с пероксидазой хрена периодатным методом [Nakane and Kawaoi, 1974]. После диализа к готовому раствору конъюгата добавляли раствор мертиолята (до 0,02%) и равный объем глицерина. Конъюгат хранили при  20. Подбор пар МКА, образующих сэндвич с HBsAg проводили, как описано ранее [Nikulina et al., 2000]. Оптимизация рН сорбции антител. Для оптимизации рН сорбции антител на поверхности иммунных планшетов готовили буферы со следующими значениями рН: 0,1 М трис-глициновый рН 2,8; 0,025 М Na-фосфатный рН 7,5 и 0,05 М гидрокарбонатный рН 9,5. Антитела (3 мкг/мл) растворяли в указанных буферах и насыщали полоски иммунных планшетов (100 мкл антител на лунку) в течение ночи при комнатной температуре. Определение HBsAg в сыворотке крови. При определении HBsAg в сыворотке крови инкубационная смесь конечным объемом 200 мкл включала: 150 мкл неизвестного образца сыворотки крови (или 150 мкл стандарта, разведенного в сыворотке крови, заведомо не содержащей HBsAg) и 50 мкл раствора конъюгата антител с пероксидазой хрена в ИФА-буфере, либо в разводящем растворе НПО "Диагностические системы" в концентрации 1,4 мкг/мл. Планшеты инкубировали при покачивании на шейкере 75 мин при 420, споласкивали 4-5 раз отмывающим буфером и проводили окрашивание с помощью тетраметилбензидина (ТМБ). Определение минимальной достоверно определяемой концентрации HBsAg в сыворотке крови. Минимальная достоверно определяемая концентрация рассчитывалась как превышение поглощения при тестируемой концентрации антигена над поглощением, даваемым нулевым стандартом 3 среднеквадратичных отклонения для n=5. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Получение панели гибридом для конструирования сэндвич-метода и характеристика секретируемых антител После слияния спленоцитов иммунной мыши с миеломой X63Ag8.653 в культуральных супернатантах определяли активность МКА по их связыванию с иммобилизованным HВsAg. В результате шести слияний для дальнейшей работы было отобрано шесть клонов, антитела которых можно было обнаружить в твердофазном ИФА при разведении культуральных супернатантов в 2×104 - 4×104 раз. МКА, секретируемые этими гибридомами (после трехкратного клонирования), были очищены из асцитных жидкостей путем ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефарозе. Чистоту очищенных МКА проверяли с помощью SDS-ПААГ электрофореза в 12,5% полиакриламидном геле. Во всех очищенных препаратах МКА нашей панели выявляли два полипептида с молекулярными массами (23-25 кДа и 45-48 кДа), что соответствует мол. массе легких и тяжелых цепей IgG. Минорные полосы практически не обнаруживались. Таким образом, чистота полученных МКА превышала 95% (данные не приводятся). Антитела всех отобранных нами гибридом тестировали на связывание с различными иммобилизованными препаратами HВsAg (белком, очищенным из крови и рекомбинантными HBsAg серотипов adw и ayw). Рис. 1 иллюстрирует связывание антител клона 18С8 (МКА 18С8) с иммобилизованным HBsAg. Рис. 1. Связывание МКА 18С8 с различными препаратами HBsAg, иммобилизованными на поверхность иммунных планшетов. □—□ – кривая связывания с HBsAg, очищенном из крови; ■—■ – кривая связывания с рекомбинантным HBsAg серотипа adw; ▲—▲ – кривая связывания с рекомбинантным HBsAg серотипа ayw. Планшеты насыщали указанным препаратом HBsAg и последовательно инкубировали с антителами и конъюгатом [кролик, анти-мышь].

Похожие:

	Клиническая иммунология Клиническая иммунология: Учебно-методическое обеспечение самостоятельной работы / А. А. Савченко. – Красноярск: Сиб федер ун-т, 2011....		Клинико-иммунологическая характеристика больных атопическим дерматитом... Учитель истории и обществознания Гусевской средней общеобразовательной школы Бабаева С. В
	Феноменология иммунного ответа на т-независимые антигены 2-го типа... В этом плане явились мероприятия, проведенные в 9-11 классах «Нет – наркотикам», «Мы за здоровый образ жизни» с приглашением мед...		Сравнительная характеристика натуральных киллерных клеток человека... Охватывает те же этапы, что и протокол предложенный Хиллом, но компания предлагает использовать свою среду неизвестного пользователю...
	Возможности лаборатории Центра крови 1-го мгму имени И. М. Сеченова Обследование доноров: определение hbsAg, антител к вирусу гепатита С, вич, сифилису		Метод определения биологического возраста по спирографии Белозерова Л. М., Одегова Т. В. Метод определения биологического возраста по спирографии // Клиническая геронтология. 2006. Т. 12,...
	Иммунология клиническая иммунология Основной целью обучения является усвоение определенной суммы информации по предмету, а также выработка и развитие у студентов умений...		Иммунология клиническая иммунология Основной целью обучения является усвоение определенной суммы информации по предмету, а также выработка и развитие у студентов умений...
	Образовательное учреждение высшего профессионального образования Днк-технологий для выявления генов высокой продуктивности и устойчивости к заболеваниям; диагностики болезней животных посредством...		Методические рекомендации по организации изучения дисциплины 62 Протокол... «Иммунология – клиническая иммунология» состоит в овладении знаниями по изучению иммунной системы организма человека, форм иммунного...
	Решена ли проблема корректного определения элементов вторичной структуры? Данный метод был использован для того, чтобы ранжировать шесть методов определения вторичной структуры: stride, dssp, secstr, kaksi,...		Программа факультативной дисциплины «Аллергология и иммунология» Формирование специальных профессиональных знаний и умений в области клинической иммунологии, аллергологии, необходимых для эффективной...
	Программа факультативной дисциплины «Аллергология и иммунология» Формирование специальных профессиональных знаний и умений в области клинической иммунологии, аллергологии, необходимых для эффективной...		Рабочей учебной программы по дисциплине общая и клиническая иммунология...
	Рабочая программа дисциплины дисциплина сд. Р «Клиническая иммунология» Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования		Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Образовательный стандарт послевузовской профессиональной подготовки врача по специальности «аллергология и иммунология», образовательные...