Сэндвич-метод иммуноферментного определения hbsAg с помощью рн чувствительных сорбируемых моноклональных антител 14. 03. 09 клиническая иммунология, аллергология

Влияние рН адсорбции антител на параметры сэндвич-метода Известно, что в случае некоторых антител увеличение рН адсорбции на твердую фазу (до 9,5) может приводить к увеличению аналитической чувствительности анализа [Sponholtz, 1995]. Для всех пар МКА нашей панели, дающих эффективный сэндвич (k>0,6), было проанализировано, каким образом рН адсорбции антител влияет на результативность метода. Строили калибровочные кривые, в которых МКА сорбировали при значениях рН равных 2,8; 7,5 и 9,5. Сводные данные по изменению коэффициентов калибровочных кривых в зависимости от рН адсорбции приведены на Рис. 3 (коэффициенты калибровочной кривой для рН сорбции 7,5 принят за 100%). Иммобилизованные антитела 18С8 1 18С8 18С8 F4F3 F4F3 D5B4 D5B4 D9B1 D9B1 D9B1 D13A6 F9B2 Детектирующие антитела F9B2 F4F3 D9B1 D5B4 F4F3 D9B1 D5B4 F9B2 F4F3 F4F3 D9B1 Рис. 3. Влияние рН сорбции иммобилизуемых антител на коэффициент калибровочной кривой с различными парами иммобилизованных и детектирующих антител. Коэффициент кривой при рН 7,5 принят за 100%. При увеличении рН адсорбции МКА с 7,5 до 9,5 не удалось зарегистрировать существенных изменений коэффициентов калибровочных кривых. Следует отметить, что при иммобилизации МКА при нейтральных и щелочных рН ни одна пара антител (иммобилизованных и детектирующих) не давала лучшей калибровочной кривой, чем [F9B2, иммобилизованные МКА, - D9B1, детектирующие МКА] (Рис. 2, кривая 1). Вместе с тем, при уменьшении рН адсорбции с 7,5 до 2,8 наблюдались значительные изменения аналитической чувствительности метода. Некоторые МКА (D9B1 и F9B2) после иммобилизации при кислых рН практически полностью инактивировались. В других случаях, после адсорбции МКА в кислых условиях коэффициенты калибровочных кривых уменьшались в 2-3 раза (см. данные для иммобилизованных МКА F4F3 и D5B4 на Рис. 3). Наибольший интерес представляет феномен повышения аналитической чувствительности сэндвич-метода в случае иммобилизации МКА 18С8 при рН 2,8 - коэффициенты кривых увеличиваются в 1,8 – 2, 2 раза (см. пары [18С8, иммобилизованные МКА, – F9B2, детектирующие МКА] и [18C8, иммобилизованные МКА, – F4F3, детектирующие МКА] на Рис. 3). Следует также обратить внимание, что при адсорбции антител при рН 7,5 самой эффективной конфигурацией была пара [F9B2, иммобилизованные МКА. - D9B1, детектирующие МКА]. Коэффициент калибровочной кривой (к) в этом случае был 1,04 (Рис. 2, кривая 1). Однако уменьшение рН адсорбции МКА до 2,8 делало не менее эффективной пару [18С8, иммобилизованные МКА, - F4F3, меченые МКА]. Коэффициент калибровочной кривой (к) для указанной системы составлял 1,11 (Рис. 4, кривая 1, сравнить с кривой 2). Из теории сэндвич-метода следует, что чем выше концентрация активных антигенсвязывающих сайтов на поверхности твердой фазы, тем больше сдвинуто равновесие в сторону образования иммунного комплекса [иммобилизованные антитела - антиген   детектирующие антитела] и тем выше чувствительность анализа [Portsmann and Kiessig, 1992]. С другой стороны, известно, что при пассивной адсорбции на твердую фазу от 90 до 99% МКА утрачивают антигенсвязывающую активность [Butler, 2004]. Таким образом, феномен увеличения чувствительности метода после адсорбции МКА 18С8 при кислых рН может быть обусловлен увеличением концентрации активных антигенсвязывающих сайтов на поверхности планшетов. Можно предположить два различных механизма достижения указанного эффекта. Во-первых, возможно, при кислых рН к твердой фазе прикрепляется гораздо больше МКА 18С8, чем при нейтральных или щелочных рН, причем кислые условия не приводят к снижению активности данных антител. (1) (2) (3) (4) Рис. 4. Калибровочные кривые в сэндвич-методе тестирования HBsAg при различных рН сорбции иммобилизуемых антител. кривая (1): пара 18С8 (иммобилизованные при рН 2,8) – F4F3 (детектирующие); кривая (2): пара F9B2 (иммобилизованные при рН 7,5) – D9B1 (детектирующие); кривая (3): пара 18С8 (иммобилизованные при рН 7,5) – F4F3 (детектирующие); кривая (4): пара F9B2 (иммобилизованные при рН 2,8) – D9B1 (детектирующие); Второе предположение состоит в том, что при адсорбции в кислых условиях к твердой фазе прикрепляется столько же (или даже меньше) молекул МКА 18С8 (по сравнению с нейтральным и щелочным рН), однако низкие значения рН адсорбции способствуют лучшему сохранению биологической активности указанных антител. Для выяснения причин наблюдаемого эффекта, мы проанализировали, во-первых, каким образом рН адсорбции влияет на количество МКА 18С8 на твердой фазе, и, во-вторых, в какой мере МКА 18С8 сохраняют биологическую активность после их адсорбции при кислых рН. Для определения относительного количества антител, которые прикрепляются к твердой фазе при различных рН, биотинилированные МКА 18С8 адсорбировали при двух значениях рН: 7,5 и 2,8. В качестве параметра, который характеризует относительное количество МКА, связавшихся с твердой фазой, мы использовали коэффициенты кривых связывания стрептавидин-пероксидазы с иммобилизованными биотинилированными МКА. Этот параметр прямо коррелирует с количеством МКА, иммобилизованных на твердой фазе. Из данных, представленных на Рис. 5 а, следует, что кривые связывания стрептавидин-пероксидазы с биотинилированными МКА 18С8, адсорбированными при рН 2,8 и рН 7,5, практически совпадают. а б Рис. 5. Свойства антител клона 18С8 иммобилизованных на поверхность иммунных планшетов при нейтральных и кислых рН. а – связывание стрептавидин-пероксидазы с биотинилированными антителами, иммобилизованными при рН 7,5 и при рН 2,8; б – связывание HBs-антигена, меченого пероксидазой хрена, с антителами, иммобилизованными при рН 7,5 и при рН 2,8. Можно заключить, что при нейтральных и кислых рН на поверхность иммунных планшетов иммобилизуется одинаковое количество молекул антител. В следующем эксперименте мы оценивали относительное количество активных антигенсвязывающих сайтов при адсорбции МКА 18С8 при нейтральных и кислых рН. Для этого анализировали связывание HВsAg, меченого пероксидазой хрена, с МКА 18С8, иммобилизованными при упомянутых рН. Данные, представленные на Рис. 5 б свидетельствуют, что коэффициент кривой связывания меченого антигена с МКА 18С8, иммобилизованными при рН 2,8 (к=5,3×10-2, сплошная линия), в два раза больше коэффициента кривой связывания с МКА, адсорбированными при рН 7,5 (к=2,610-2, пунктирная линия). Следовательно, с МКА, адсорбированными при рН 2,8, связывается в два раза больше меченого HBsAg, чем с антителами, иммобилизованными при рН 7,5. Таким образом, улучшение параметров сэндвич-метода после адсорбции МКА 18С8 при кислых рН сопряжено с лучшим сохранением их биологической активности, хотя к твердой фазе при нейтральных и кислых рН прикрепляется одинаковое количество антител. Оптимизация концентрации иммобилизованных антител и времени инкубации В следующей серии экспериментов мы оптимизировали концентрацию МКА 18С8 при их иммобилизации на твердую фазу при рН 2,8, а также время инкубации в сэндвич-методе. Для определения оптимальной концентрации МКА при иммобилизации на твердую фазу антитела сорбировали на поверхность иммунных планшетов в концентрациях 1, 3, 4 и 6 мкг/мл в течение ночи при комнатной температуре и, после иммобилизации строили калибровочные кривые с детектирующими МКА F4F3, мечеными пероксидазой хрена. Данные, представленные на Рис. 6 а, свидетельствуют, что увеличение концентрации сорбируемых антител с 1 до 3 мкг/мл приводит к существенному улучшению параметров калибровочной кривой: коэффициент кривой возрастает с 0,35 до 1,29 (см. Рис. 6 ,а, сравнить кривые 1 и 4). (1) (1) (2) (2) (3) (4) (3) (4) а б Рис. 6. Оптимизация концентрации сорбируемых антител (а) и времени инкубации (б) в сэндвич-методе тестирования HBsAg c парой антител [18С8 , иммобилизованные МКА, - F4F3, детектирующие МКА]. а) МКА 18С8 сорбировали на иммунные планшеты при рН 2,8 в концентрациях 1, 3, 4 и 6 мкг/мл. б) калибровочные кривые при различных временах инкубации (температура 420, покачивание на шейкере). Дальнейшее увеличение концентрации сорбируемых антител до 4 и 6 мкг/мл не приводит к улучшению параметров калибровочной кривой: коэффициенты кривых (1), (2) и (3) весьма близки (варьируют от 1,29 до 1,05). Таким образом, концентрация 3 мкг/мл, при которой достигается лучший результат, является оптимальной для сорбции МКА 18С8 при рН 2,8. Оптимизацию времени инкубации в сэндвич-методе при 42о иллюстрирует Рис. 6 б. Увеличение времени инкубации с 30 до 75 минут приводит к увеличению коэффициента калибровочной кривой с 0,25 до 0,82 (см. кривые 4 и 2). Дальнейшее увеличение времени инкубации до 90 минут не влияет существенным образом на параметры калибровочной кривой (коэффициент кривой возрастает всего на 13% - с 0,82 до 0,92) (см. кривые 2 и 1 на Рис. 6, б). Таким образом, оптимальное время инкубации равно 75 - 90 минутам. Отметим, здесь приведены кривые, полученные при покачивании иммунных планшетов на шейкере. Если планшеты инкубировать без покачивания, то оптимальное время инкубации увеличивается с 75 до 120 минут (данные не приводятся). Доказательства иммунологической тождественности рекомбинантных HBsAg и иммунореактивного HBsAg из сыворотки крови больных, инфицированных вирусом гепатита В В следующем эксперименте оценивали иммунологическую тождественность трех препаратов очищенных HВsAg (антиген, выделенный из крови, и рекомбинантные антигены субтипов adw и ayw). Очищенные рекомбинантные белки HBsAg и антиген, очищенный из крови, использовали для приготовления стандартов при построении калибровочных кривых. В качестве неизвестного образца использовали смесь сывороток больных, инфицированных вирусом гепатита В, которую разводили (кратно стандартам) сывороткой, свободной от HBsAg. Полученные данные представлены на Рис. 7. Можно видеть, что коэффициенты всех четырех кривых очень близки: варьируют от 0,8 для рекомбинантного антигена субтипа adw до 1,07 для антигена, очищенного из крови (отклонение от среднего не превышает 15%), что является весьма удовлетворительным результатом для экспериментов подобного рода. В своей совокупности, эти данные свидетельствует, что в сконструированном нами сэндвич-методе препараты HBs-антигенов серотипов adw и ayw, антиген, выделенный из крови и образец смеси сывороток больных, инфицированных вирусом гепатита В, воспринимаются как идентичные субстанции. Таким образом, сконструированный нами сэндвич-метод одинаково хорошо определяют HBsAg серотипов adw и ayw в сыворотках больных, инфицированных вирусом гепатита В. Кроме того, каждый из упомянутых очищенных препаратов можно использовать для приготовления стандартов при построении калибровочных кривых. Рис. 7. Калибровочные кривые в сэндвич-методе тестирования HBsAg c различными препаратами HВsAg □—□ HBsAg очищенный из крови; ■—■ очищенный рекомбинантный HBsAg серотипа ayw; ∆—∆ смесь сывороток больных гепатитом В; ▲—▲ очищенный рекомбинантный HBsAg серотипа adw. Минимальная достоверно определяемая концентрация HBsAg Для сэндвич-метода с использованием пары антител [18С8, иммобилизованные МКА, - F4F3, меченые МКА], определяли минимальную достоверно определяемую концентрацию антигена. Эту величину вычисляли для двух условий сорбции МКА 18С8 (при рН 7,5 и при рН 2,8), используя три независимо полученных препарата меченых антител (конъюгатов МКА F4F3 с пероксидазой, всего три препарата). В качестве стандарта использовали отраслевой стандарт НПО "Диагностические системы". Минимальная достоверно определяемая концентрация для n=5 (превышение поглощения при тестируемой концентрации над поглощением, даваемым нулевым стандартом 3 среднеквадратичных отклонения) при рН 7,5 сорбции для трех препаратов конъюгата составляла: 0,1, 0,17 и 0,11 нМЕ/мл. Для рН сорбции 2,8 этот параметр (для тех же препаратов конъюгата) равнялся 0,014, 0,017 и 0,013 МЕ/мл. Таким образом, очень простой методический прием – адсорбция антител при рН 2,8, позволил увеличить минимальную достоверно определяемую концентрацию антигена практически на порядок. Определение концентрации HBsAg в образцах сывороток больных, инфицированных вирусом гепатита В В следующих экспериментах оценивалось, насколько эффективно сконструированный нами сэндвич-метод позволяет определять HBsAg в образцах сывороток крови больных, инфицированных вирусом гепатита В. Было проанализировано 212 образцов сывороток, заведомо содержащих HВsAg. Во всех образах наличие HBsAg было подтверждено сконструированным нами сэндвич-методом (данные не приводятся). HBsAg анализировался также в панели образцов, которая содержала различные субтипы антигена. Панель (МБС, г. Новосибирск) включала 18 образцов, два из которых не содержали HBsAg (отрицательные образцы) и 16 образцов содержали HBsAg различных субтипов (концентрация HBsAg в образцах панели дается производителем). Результаты анализа приводятся в Табл. 2. Можно видеть, что наличие (или отсутствие в отрицательных образцах) HBsAg, заявляемое производителем, было полностью подтверждено результатами нашего анализа. В большинстве образцов (например, в № 1, 5, 6 и 12) наблюдалось хорошее соответствие между концентрацией, указанной производителем, и концентрацией, которая определялась нами. - Вместе с тем, в некоторых образцах панели (№ 4, 9, 10 и 16) уровень антигена, определяемый нами, существенно отличался от указанного производителем. В целом, можно заключить, что сконструированный нами сэндвич-метод позволил весьма эффективно определить HBsAg (или констатировать его отсутствие) в образцах сертифицированной панели, включавшей HBsAg следующих субтипов: аyw2, аyw3varB, аyw3varА, и аdr.

Похожие:

	Клиническая иммунология Клиническая иммунология: Учебно-методическое обеспечение самостоятельной работы / А. А. Савченко. – Красноярск: Сиб федер ун-т, 2011....		Клинико-иммунологическая характеристика больных атопическим дерматитом... Учитель истории и обществознания Гусевской средней общеобразовательной школы Бабаева С. В
	Феноменология иммунного ответа на т-независимые антигены 2-го типа... В этом плане явились мероприятия, проведенные в 9-11 классах «Нет – наркотикам», «Мы за здоровый образ жизни» с приглашением мед...		Сравнительная характеристика натуральных киллерных клеток человека... Охватывает те же этапы, что и протокол предложенный Хиллом, но компания предлагает использовать свою среду неизвестного пользователю...
	Возможности лаборатории Центра крови 1-го мгму имени И. М. Сеченова Обследование доноров: определение hbsAg, антител к вирусу гепатита С, вич, сифилису		Метод определения биологического возраста по спирографии Белозерова Л. М., Одегова Т. В. Метод определения биологического возраста по спирографии // Клиническая геронтология. 2006. Т. 12,...
	Иммунология клиническая иммунология Основной целью обучения является усвоение определенной суммы информации по предмету, а также выработка и развитие у студентов умений...		Иммунология клиническая иммунология Основной целью обучения является усвоение определенной суммы информации по предмету, а также выработка и развитие у студентов умений...
	Образовательное учреждение высшего профессионального образования Днк-технологий для выявления генов высокой продуктивности и устойчивости к заболеваниям; диагностики болезней животных посредством...		Методические рекомендации по организации изучения дисциплины 62 Протокол... «Иммунология – клиническая иммунология» состоит в овладении знаниями по изучению иммунной системы организма человека, форм иммунного...
	Решена ли проблема корректного определения элементов вторичной структуры? Данный метод был использован для того, чтобы ранжировать шесть методов определения вторичной структуры: stride, dssp, secstr, kaksi,...		Программа факультативной дисциплины «Аллергология и иммунология» Формирование специальных профессиональных знаний и умений в области клинической иммунологии, аллергологии, необходимых для эффективной...
	Программа факультативной дисциплины «Аллергология и иммунология» Формирование специальных профессиональных знаний и умений в области клинической иммунологии, аллергологии, необходимых для эффективной...		Рабочей учебной программы по дисциплине общая и клиническая иммунология...
	Рабочая программа дисциплины дисциплина сд. Р «Клиническая иммунология» Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования		Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Образовательный стандарт послевузовской профессиональной подготовки врача по специальности «аллергология и иммунология», образовательные...