Сэндвич-метод иммуноферментного определения hbsAg с помощью рн чувствительных сорбируемых моноклональных антител 14. 03. 09 клиническая иммунология, аллергология

Можно видеть, что коэффициенты кривых связывания МКА 18С8 с HBsAg из различных источников варьируют весьма незначительно: от 7,2×10 1 (для кривой связывания с HBsAg, очищенным из крови) до 6,3×10-1 (кривая связывания с рекомбинантным HBsAg серотипа adw). Таким образом, МКА 18С8 одинаково специфичны при связывании с HBsAg обоих тестированных серотипов и антигеном, очищенном из крови. Сходные результаты были получены для других МКА нашей панели (данные не приводятся). Кроме того, нами был определен изотип всех очищенных МКА (изотип антител приводится в Табл. 1). В иммуноблоттинге (после электрофореза в 12,5% ПААГ в присутствии SDS) с рекомбинантным HBsAg серотипа adw, все МКА панели окрашивали полипептид, с мол. массой 24-26 кДа (Рис. 2), что совпадает с мол. массой рекомбинантного HBsAg и соответствует мол. массе S-белка нативного HBsAg (данные не приводятся). Таблица 1. Подбор пар моноклональных антител, образующих сэндвич с HBs-антигеном в твердофазном иммуноферментном методе Детектирующие Антитела Иммобилизованные антитела D5B4 D9B1 D13A6 F4F3 F9F2 18С8 D5B4 (IgG1) - + - + - - D9B1 (IgG2b) + - + + + - D13A6 (IgG1) - - - - - - F4F3 (IgG1) + + + - - + F9F2 (IgG2a) - + - - - + 18С8 (IgG1) - - - - - - Иммунные планшеты насыщали указанными антителами и инкубировали с HBsAg в присутствие антител, меченных пероксидазой хрена (детектирующих антител). Подбор пар моноклональных антител, образующих сэндвич с HBsAg Для подбора пар антител, образующих сэндвич с HBsAg, антитела каждого из клонов панели тестировались как иммобилизованные (антитела сорбировали при рН 7,5) и как детектирующие (конъюгированные с пероксидазой хрена). Важно отметить, что для всех пар тестируемых МКА концентрация иммобилизованных антител и концентрация детектирующих антител в инкубационной смеси были одинаковы. В качестве параметра, который характеризует эффективность тестируемой пары МКА, мы использовали коэффициенты калибровочных кривых (тангенс угла наклона линейного участка калибровочной кривой к оси концентраций в координатах: концентрация HBsAg/поглощение, Рис. 2). Коэффициент кривой прямо характеризует аналитическую чувствительность метода (изменение регистрируемого сигнала на единицу изменения концентрации антигена). (1) (2) (3) (4) Рис. 2. Калибровочные кривые в сэндвич-методе тестирования HВs-антигена с различными парами иммобилизованных и детектирующих антител панели гибридом. кривая (1): пара F9B2 (иммобилизованные) – D9B1 (детектирующие); кривая (2): пара 18С8 (иммобилизованные) – F4F3 (детектирующие); кривая (3): пара D5B4 (иммобилизованные) – D5B4 (детектирующие); кривая (4): пара F9B2 (иммобилизованные) – F4F3 (детектирующие). Условия см. "Методы исследований". Чем выше коэффициент калибровочной кривой, тем более подходит данная пара иммобилизованных и меченых антител для конструирования эффективного сэндвич-метода. На Рис. 2 приведены итоги тестирования для нескольких пар антител нашей панели2. Можно видеть, что некоторые пары антител, например, пара [F9B2, иммобилизованные МКА, – D9B1, детектирующие МКА] дает эффективную калибровочную кривую (Рис. 2, кривая 1, к=1,04). Сходные результаты получены с парой антител [18С8 , иммобилизованные МКА – F4F3, детектирующие МКА] (Рис. 2, кривая 2, к=0,59). Вместе с тем, пара антител [F9B2, иммобилизованные МКА, – F4F3, детектирующие МКА] практически не дает калибровочной кривой (Рис. 2, кривая 4, к=0,08). Кроме того, мы проанализировали эффективность "односайтных" сэндвич-методов, в которых МКА одного клона использовались в качестве иммобилизованных и детектирующих. Поскольку HBsAg представляет собой белковый агрегат [Block et al., 2007], можно было ожидать, что некоторые пары МКА будут образовывать сэндвич с HBsAg в таких условиях. Оказалось, что система, использующая МКА D5B4 в качестве иммобилизованных и детектирующих, позволяет получать удовлетворительную калибровочную кривую (Рис. 2, кривая 3, к=0,22). Однако остальные МКА давали значительно худшие кривые в "односайтных сэндвичах": коэффициенты кривых были меньше 0,22 (данные не приводятся). Сводные результаты по подбору пар МКА, образующих сэндвич с HВsAg, приведены в Табл. 1. Пары антител, дающие результативную калибровочную кривую, обозначены знаком (+). К ним отнесли пары МКА, дающие кривые связывания с коэффициентом выше порогового уровня 0,22 (характерного для калибровочной кривой в "односайтной" системе, использующей МКА D5B4). Из всех возможных сочетаний иммобилизованных и меченых антител нашей панели (таких сочетаний 36) только двенадцать пар давали удовлетворительную калибровочную кривую. Эти пары антител были отобраны для дальнейшей работы.

Похожие:

	Клиническая иммунология Клиническая иммунология: Учебно-методическое обеспечение самостоятельной работы / А. А. Савченко. – Красноярск: Сиб федер ун-т, 2011....		Клинико-иммунологическая характеристика больных атопическим дерматитом... Учитель истории и обществознания Гусевской средней общеобразовательной школы Бабаева С. В
	Феноменология иммунного ответа на т-независимые антигены 2-го типа... В этом плане явились мероприятия, проведенные в 9-11 классах «Нет – наркотикам», «Мы за здоровый образ жизни» с приглашением мед...		Сравнительная характеристика натуральных киллерных клеток человека... Охватывает те же этапы, что и протокол предложенный Хиллом, но компания предлагает использовать свою среду неизвестного пользователю...
	Возможности лаборатории Центра крови 1-го мгму имени И. М. Сеченова Обследование доноров: определение hbsAg, антител к вирусу гепатита С, вич, сифилису		Метод определения биологического возраста по спирографии Белозерова Л. М., Одегова Т. В. Метод определения биологического возраста по спирографии // Клиническая геронтология. 2006. Т. 12,...
	Иммунология клиническая иммунология Основной целью обучения является усвоение определенной суммы информации по предмету, а также выработка и развитие у студентов умений...		Иммунология клиническая иммунология Основной целью обучения является усвоение определенной суммы информации по предмету, а также выработка и развитие у студентов умений...
	Образовательное учреждение высшего профессионального образования Днк-технологий для выявления генов высокой продуктивности и устойчивости к заболеваниям; диагностики болезней животных посредством...		Методические рекомендации по организации изучения дисциплины 62 Протокол... «Иммунология – клиническая иммунология» состоит в овладении знаниями по изучению иммунной системы организма человека, форм иммунного...
	Решена ли проблема корректного определения элементов вторичной структуры? Данный метод был использован для того, чтобы ранжировать шесть методов определения вторичной структуры: stride, dssp, secstr, kaksi,...		Программа факультативной дисциплины «Аллергология и иммунология» Формирование специальных профессиональных знаний и умений в области клинической иммунологии, аллергологии, необходимых для эффективной...
	Программа факультативной дисциплины «Аллергология и иммунология» Формирование специальных профессиональных знаний и умений в области клинической иммунологии, аллергологии, необходимых для эффективной...		Рабочей учебной программы по дисциплине общая и клиническая иммунология...
	Рабочая программа дисциплины дисциплина сд. Р «Клиническая иммунология» Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования		Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Образовательный стандарт послевузовской профессиональной подготовки врача по специальности «аллергология и иммунология», образовательные...