Отчет по проекту №2 2/5309 «Моделирование процессов функционирования сопряженных ферментативных систем в клетке на примере ферментов светящихся бактерий» аналитической

Скачать 2.25 Mb.

Название	Отчет по проекту №2 2/5309 «Моделирование процессов функционирования сопряженных ферментативных систем в клетке на примере ферментов светящихся бактерий» аналитической
страница	17/17
Дата публикации	02.03.2015
Размер	2.25 Mb.
Тип	Отчет

100-bal.ru > Физика > Отчет

1 ... 9 10 11 12 13 14 15 16 17

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Заявленная программа работы за отчетный период успешно выполнена. Практически все ожидаемые научные и научно-технические результаты и результаты реализации итогов проекта в образовании превышены.

За отчетный период получены следующие новые результаты:

Для решения фундаментальной задачи понимания механизмов сопряжения и функционирования ферментативных метаболических цепей в клетке созданы 4 прототипа экспериментальных моделей (ЭМсахароза, ЭМглицерин ЭМкрахмал ЭМжелатин), в которых реконструирована цепь сопряжения двух ферментов светящихся бактерий (люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы) в растворах повышенной вязкости (сахарозы и глицерина), а также в матричной структуре крахмального или желатинового геля. Модели проявляет биолюминесцентную активность и имитируют вязкое микроокружение ферментов в матриксе, а также связь с мембранными структурами.
Установлены механизмы стабилизации биферментной системы светящихся бактерий путем создания благоприятного микроокружения близкого к in vivo посредством иммобилизации ферментов в гели крахмала и желатина с сохранением функциональной активность ферментов, что подтверждается спектрально-люминесцентными анализом. Показано, что наиболее эффективным механизмом стабилизации биферментной системы является совместная иммобилизация люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы, а также их субстратов и кофакторов в 3 % крахмальный гель. Биферментная система, иммобилизованная совместно с субстратами и кофакторами, сохраняет свою активность в течение длительного времени, не требует специальных условий хранения.
Показано, что иммобилизация в крахмальный и желатиновый гели приводит к значительной стабилизации биферментной системы по отношению к денатурирующим воздействиям: рН-оптимум расширяется, как в кислую, так и щелочную области, сохраняется высокая активность ферментов при увеличении концентрации солей, повышается термостабильность.
Установлено, что термоинактивация биферментной системы в желатиновом и крахмальном гелях имеет нелинейный характер и протекает по диссоциативному механизму.
Описано влияние процесса иммобилизации и вязкости среды на субстратную специфичность ферментов. Показано, что при использовании желатинового геля выход активности существенно ниже, а значения K_{m каж} для ФМН и НАДН, а также величина энергии активации более высоки, чем в случае крахмального геля. Полученные закономерности объясняются различиями в физико-химических характеристиках и природе гелеобразующих полимеров.
На примере биферментной системы светящихся бактерий показано, что изменение вязкости микроокружения оказывает влияние на механизмы сопряжения между ферментами в метаболических цепях, изменяет вероятность образования и скорость распада возбужденного интермедиата реакции.
Подобраны условия (рН, вязкость и другие физико-химические характеристики микроокружения ферментов биолюминесценой системы), при которых не происходит инактивации и термоинактивации биферментной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин и сохраняется высокая субстратная специфичность ферментов, что наилучшим образом отвечает условиям работы ферментов in vivo.
Установлена зависимость между термостабильностью биферментной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин и физико-химическими характеристиками микроокружения ферментов. Показано, что ЭМсахароза обладает большей термостабильностью по сравнению с моделью ЭМглицерин.
Установлена гидрофобная природа взаимодействий при образовании фермент-субстратных комплексов. Эффекты влияния органических веществ и органических растворителей на ферменты объясняются как их прямым действием на гидратную оболочку или на активный центр белка, так и изменением электростатических и гидрофобных внутри- и межмолекулярных взаимодействий.
Для соответствия характеристик вязких сред свойствам клеточной цитоплазмы необходимо создание комбинированной среды, содержащей высокую концентрацию макромолекул и низкую концентрацию сахаридов.
Разработана методика оценки вязкости среды на основе анизотропии флуоресценции флавинмононуклеотида и установлено, что вязкость, характерная для клеточной цитоплазмы, достигается при концентрациях растворов крахмала и желатина более 2% (при 20С).
Лучшим из 4 прототипов экспериментальных моделей является ЭМкрахмал. В крахмальном геле с добавлением ДТТ термоинактивация ферментов происходит с наименьшей скоростью. Энергия активации процесса термоинактивации биферментной системы в крахмальном геле с добавлением ДТТ в 3 раза выше по сравнению с энергией активации в буферном растворе.
Проведен анализ вклада различных механизмов и стадий реакции в кинетику свечения биферментной системы НАДН:ФМН- оксидоредуктаза-люцифераза.
На основе анализа механизмов формирования кинетических кривых свечения построена математическая модель сопряженной биферментной реакции НАДН:ФМН- оксидоредуктаза-люцифераза для описания работы экспериментальной модели.
Построенная математическая модель апробирована для описания работы экспериментальной модели в анализе кинетики свечения биферментной системы в присутствие хинонов.
Показано, что для соотвествия математической модели экспериментальным результатам необходимо учитывать следующие механизмы влияния хинонов на функционирование биферментной системы: возможность окисления хиноном субстратов биферментной реакции (ФМНН₂ или НАДН), возможность участия хинона в качестве субстрата в редуктазной реакции, изменеия активности ферментов, обусловленные конформационными изменения в присутствие хинона.
Проведено экспериментальное исследование динамики светоизлучения растворимой и иммобилизованной в крахмальный гель биферментной системы в связи с кинетикой диффузии молекул ФМН в ЭМкрахмал.
Установлена роль процессов диффузии в реакциях с использованием иммобилизованных компонентов биолюминесцентной системы светящихся бактерий. Показано, что процесс диффузии непосредственно не влияет на динамику и интенсивность светоизлучения в реакции, происходящей при совместной иммобилизации субстратов и ферментов.

Работа имеет высокую практическую значимость: разработанный многокомпонентный реагент, названный «Энзимолюм», может послужить основой для создания биолюминесцентного сенсора и проведения биолюминесцентного анализа. Разработаны и зарегистрированы в Ростехрегулировании Технические условия и каталожный лист реагента «Энзимолюм» (ТУ № 2639-001-93879568-2009 «Реагент «Энзимолюм», зарегистрированы 25.12.2009 за № 003534). Начаты процессы коммерциализации научных результатов, полученных в ходе выполнения проекта.

В рамках проекта получен 1 патент и принято положительное решение о выдаче 3-х патентов. Технология производства и использования реагента «Энзимолюм» оформлены в виде заявок на патенты РФ: № 2009110636 «Биолюминесцентный биомодуль и способ его приготовления» и № 2009113656 «Экспресс-способ биотестирования токсичности природных, сточных вод и водных растворов». «Методика измерений интенсивности биолюминесценции с использованием реагента «Энзимолюм» для определения токсичности проб питьевых, природных, сточных и очищенных сточных вод» аттестована в Федеральном государственном унитарном предприятии «Уральский научно-исследовательский институт метрологии» (Свидетельство об аттестации № 224.0137/01.00258/2010). Получен патент РФ № 2376380 «Биолюминесцентный способ определения антиоксидантной активности гуминовых веществ», принято положительное решение о выдаче патента: «Флуоресцентный способ определения концентрации кальция».

Для создания научно-образовательного пространства, включающего преподавателей, научных работников, молодых ученых и студентов и аспирантов разных специальностей развивался инновационный образовательный процесс на основе новых полученных результатов. Были разработаны новые принципы ведения научных исследований со студентами 3-5 курсов при выполнении студентами курсовых и дипломных работ по темам проекта; внедряются в учебный процесс разработанные участниками проекта Учебно-методические комплексы по дисциплинам: «Фотобиофизика», «История и методология биологии и биофизики», «Информационные технологии в научных исследованиях»; разработан проект вовлечения молодежи в инновационную деятельность в рамках Молодежной Международной Открытой Лаборатории Перспективных Исследований и Технологий (МОЛПИТ); организован Научно-образовательный семинар по биохимической физике.

В рамках проекта активно развивалось международное сотрудничество, как в науке, так и в образовании. В качестве консультантов к осуществлению исследований привлечены сотрудники зарубежных и российских университетов: Университета Болоньи (Италия), Университета Флориды (США), Центра геномных регуляций Университета Помпеи Фабра (Испания) и других. Совместно с Университетом Флориды (США) и Университетом Шанхайской организации сотрудничества разработаны концепции и проекты совместных магистерских программ «Биологическая инженерия для устойчивого развития» (США) и «Устойчивое развитие и экологическая безопасность». Подготовлены проекты Соглашения о сотрудничестве с Университетом Флориды (США), Университетом Болоньи (Италия), Центром геномных регуляций Университета Помпеи Фабра (Испания), фирмой «НовоСИБ» (Леон, Франция)..

Проведен сравнительный анализ программы и учебных планов магистерских программ и методов обучения кафедры биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ и Департамента сельского хозяйства и биологической инженерии Университета Флориды (США). Разработана концепция совместной магистерской программы кафедры биофизики СФУ и Департамента сельского хозяйства и биологической инженерии Университета Флориды (США). Разработаны учебные планы совместной магистерской программы кафедры биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии и Департамента сельского хозяйства и биологической инженерии Университета Флориды (США). В программу Темпус подготовлен проект создания совместной магистерской программы по направлению «Радиоэкология». Методические разработки, и практические рекомендации, полученные при выполнении Проекта, будут использованы в деятельности по продвижению образовательных технологий, созданию совместных международных магистратур и научных достижений по разработке инновационных технологий для устойчивого развития и их продвижению международные рынки образовательных услуг СФУ.

В дальнейшем предполагается продолжение работ по теме проекта по этапу «Разработка и экспериментальная проверка кинетических моделей взаимодействия люцифераз с ингибиторами и активаторами.

Основными задачами будущего исследования являются:

Разработка кинетических моделей взаимодействия бактериальной люциферазы с ингибиторами и активаторами.
Экспериментальная проверка кинетических моделей взаимодействия бактериальной люциферазы с ингибиторами и активаторами.
Экспериментальная проверка кинетических моделей для анализа взаимодействия люцифераз различных организмов (бактерий, светляков, кишечнополостных) с ингибиторами и активаторами

В ходе будущих работ ожидается получить следующие результаты:

Будут разработаны модели взаимодействия бактериальной люциферазы с ингибиторами и активаторами.

Будет экспериментально проверена кинетическая модель взаимодействия бактериальной люциферазы с ингибиторами и активаторами, экспериментально определена природа взаимодействия (гидрофобная или электростатическая) с эффекторами различной природы. Будут оценена предсказательная сила предлагаемой модели.

Будут выявлены закономерности взаимодействия с макромолекулами природного происхождения - гуминовыми веществами с компонентами бактериальной биолюминесцентной системы в процессах детоксикации растворов солей металлов (включая радиоактивные) и углеводородов.

Будут охарактеризованы взаимодействия компонентов бактериальной биолюминесцентной системы с радиоактивными элементами на примере альфа- и бета–излучающих радионуклидов америция -241 и трития.

Будут проанализированы взаимодействия люцифераз различных организмов (бактерий, светляков, кишечнополостных) с рассеянными элементами на примере тяжелых галоидов – брома и иода.

Будут выявлены закономерности взаимодействия люциферазы кишечнополостных с субстратами при варьировании концентрации кальция в биолюминесцентной реакции.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
Белова, А.Б., Можаев, В.В., Левашов, А.И., Сергеева, М.В., Мартинек, К., Хмельницкий Ю.Л. Взаимосвязь физико-химических характеристик органических растворителей с их денатурирующей способностью по отношению к белкам. //Биохимия, 1991. т.56. с.1923-1945.

Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1998.

Волькенштейн М.В. Молекулярная биофизика. М.: Наука, 1975. 616 c.

Глинченко А.С., Дектерев М.Л., Захарьин К.Н., Егоров Н.М., Комаров В.А., Сарафанов А.В., Суковатый А. Г. Исследование полупроводниковых приборов на основе специализированного сетевого аппаратно-программного комплекса. Версия 1.0 [Электронный ресурс]: электрон. учеб. пособие / – Электрон. дан. (25 Мб). – Москва : ДМК-Пресс, 2009 а.

Глинченко А.С., Дектерев М. Л. , Захарьин К. Н. , Комаров В. А., Сарафанов А.В. Сетевой учебно-исследовательский центр коллективного пользования уникальным лабораторным оборудованием на базе веб-портала как элемент системы дистанционного образования // Открытое образование: научн.-практ. журн. – М., 2009 б. – № 5. С.18−29.

Глинченко А. С., Егоров Н. М, Комаров В.А., Сарафанов А. В. Исследование параметров и характеристик полупроводниковых приборов с применением интернет-технологий: учеб. пособие / – М. : ДМК-Пресс, 2008. – 352 с.

Дектерев М. Л., Комаров В. А., Сарафанов А. В., Суковатая И. Е., Суковатый А. Г., Худоногов Д. Ю. Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2010613017. Управление учебно-исследовательским аппаратно-программным комплексом аудиометрии на базе персонального компьютера / – М.: Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам (РОСПАТЕНТ), 2010.

Демченко А.П. Люминесценция и динамика структуры белков. Киев: Наукова думка. 1988.

Джеймс Т.Х. Желатина. В кн. Теория фотографического процесса. Л.: Химия, 1980. с.55-70.

Илларионов Б.А., Протопопова М.В., Каргинов В.А., Мертвецов Н.П., Гительзон И.И. Нуклеотидная последовательность генов - и -субъединиц люциферазы Photobacterium leiognathi. // Биоорганическая химия. 1988. T.14. c.412 – 415.

Комаров В.А., Сарафанов А. В. Разработка математической модели многопользовательского режима функционирования аппаратно-программных комплексов с удаленным доступом // Информационные технологии : Науч.-техн. журн. – М., 2009. – № 3. С. 67–74.

Кудряшева Н.С. Механизм формирования электронно-возбужденных состояний в бактериальной биолюминесценции // Диссертация на соиск. уч. ст. доктора ф.-м. н. Красноярск, 2004.

Кузьмин Е.В., Кузьмина Р.И. Гелеобразование и клеточный анабиоз. Ч.2. Препринт №454Ф. Красноярск: ИФ СО РАН СССР. 1987.

Никольский Б.П., Григоров О.Н., Позин М.Е. и др. Справочник химика. Т. 3: Химическое равновесие и кинетика. Свойства растворов. Электродные процессы. М:Госхимиздат, 1963.

Петушков В. Н., Кратасюк Г. А., Родионова Н. С., Фиш А. М., Белобров П. И. Биферментная система NADH:FMN-оксидоредкутаза-люцифераза из светящихся бактерий // Биохимия, 1984. т.49, вып.4, с.692-703.

Тривен М. Иммобилизованные ферменты. М.: Мир. 1983.

Fischer A.J., Thompson T. B., Thoden J. B., Baldwin T. O., Rayment I. The 1.5-Å resolution crystal structure of bacterial luciferase in low salt conditions. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. p.21956–21968.

Kramers H.A. Brownian motion in a field of force and the diffusion model of chemical reactions. // Physica. 1940. V.7. p.284–304.

Lacowicz J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. New-York: Springer. 2006.

Lee J. Lumazine protein and the excitation mechanism in bacterial bioluminescence. // Biophys. Chem. 1993. V.48. p.149-158.

Mejri M., Pauthe E., Larreta-Garde V., Mathlouthi M. Effect of polyhydroxylic additives on the catalytic activity of thermolysin. // Enzyme Microb. Technol. 1998. V.23. p.392-396.

Pocker Y., Janjic N. Enzyme kinetics in solvent of increased viscosity. Dynamic aspects of carbonic anhydrase catalysis. // Biochemistry , 1990. V.26. p.2597-2606.

Uribe S., Sampedro J.G. Measuring Solution Viscosity and its Effect on Enzyme Activity. // Biol. Proced. Online, 2003. V.5., N1. p.108-115.

Tanner J. J., Lei B., Tu S.-C., Krause K. L. Flavin reductase P: structure of a dimeric enzyme that reduces flavin. // Biochemistry. 1996. V.35. p.13531-13539.

Tu Shiao-Chun Activity coupling and complex formation between bacterial luciferase and ﬂavin reductases // Photochem. Photobiol. Sci., 2008. V.7. P.183–188.

Vetrova E. V., Kudryasheva N. S., Visser A. J. W. G., van Hoek A. Characteristics of endogenous flavin fluorescence of Ph. leiognathi luciferase and V. fischeri NAD(P)H:FMN-oxidoreductase. // Luminescence, 2005, V.20, pp. 205-209.

Vetrova E.V., Kudryasheva N.S., Kratasyuk V. A. Redox compounds influence on the NAD(P)H:FMN-oxidoreductase – luciferase bioluminescent system // Photochem. Photobiol. Sci., 2007, V.6, p.35-40.

1 ... 9 10 11 12 13 14 15 16 17

	Тема: Ферменты как биологичексие катализаторы. Кинетика ферментативных реакций Цель: Установить основные принципы обнаружения ферментов в биологических объектах (на примере амилазы и уреазы). Ознакомиться с основными...		Реферат Разработка метода оценки физического состояния спортсменов... Разработка метода оценки физического состояния спортсменов с использованием биолюминесцентной системы светящихся бактерий
	Метаболизм: фазы и стадии. Общий путь катаболизма Формирование представлений о метаболизме как совокупности взаимосвязанных ферментативных реакций в клетке, специфических и общей...		Рабочая программа моделирование транспортных процессов направление... Моделирование транспортных процессов: рабочая программа / авт сост. В. Б. Вилков, спб.: Ивэсэп, 2013. – 21 с
	Агентно-ориентированное моделирование поведения сложных систем в среде интернет Представлена реализация среды моделирования на основе системы моделирования дискретных событий, позволившая комплексировать агентно-ориентированное...		Математическое моделирование экономических систем «Основы математического моделирования экономических систем» должно способствовать развитию у студентов более глубокого понимания...
	Примерной программы дисциплины Компьютерное моделирование систем... Срс) различного назначения, в том числе систем мобильной связи (смс) и систем радиодоступа (срд), а также обеспечить развитие...		Рабочая программа по дисциплине опд. Ф. 08 Моделирование и оптимизация... Курс «Моделирование и оптимизация технологических процессов» является прикладной наукой, занимающейся вопросами моделирования рациональных...
	Рабочая программа по дисциплине опд. Ф. 08 Моделирование и оптимизация Курс «Моделирование и оптимизация технологических процессов» является прикладной наукой, занимающейся вопросами моделирования рациональных...		Отчет по проекту №38: Разработка рекомендаций по реализации Болонского... Программы: Научно-методическое обеспечение функционирования и модернизации системы образования
	Квантово-химическое моделирование нелинейно-оптических характеристик... Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте органической и физической химии		Тема Бактерии Бактерии. Многообразие бактерий. Строение и жизнедеятельность бактерий. Размножение бактерий
	Нормальная физиология Обучение системному подходу в процессе изучения физиологических механизмов и процессов, лежащих в основе функционирования органов...		Программа научного семинара " Моделирование и оптимизация бизнес процессов " Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов направления 080500. 68 Бизнес-информатика...
	Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину,...		Рабочая программа учебной дисциплины проектирование информационных... Целью дисциплины является: изучение методологии структурного анализа, моделирование информационных систем в стандарте idef, проектирование...

Похожие: