ВВЕДЕНИЕ
Одной из важных задач современной образовательной реформы в России является развитие совместных научных и научно-образовательных программ и проектов с зарубежными партнерами, научной и академической мобильности в рамках международного сотрудничества, научно-методическое обеспечение подготовки научных кадров в высшей школе и развития научно-исследовательской работы студентов и аспирантов.
В проекте представлены исследования по направлению «Моделирование процессов функционирования сопряженных ферментативных систем в клетке на примере ферментов светящихся бактерий», в рамках которого планируется организация и развитие совместных научных и научно-образовательных программ и проектов с зарубежными партнерами: Университет Флориды (США), Университет Болоньи (Италия), страны Шанхайской организации сотрудничества и др.
В последние годы получено много новых данных о молекулярной организации клетки. Клетку уже больше не рассматривают просто как вместилище равномерно распределенных ферментов и субстратов, так как установлено, что ее составные части и происходящие в ней процессы организованы совершенно определенным образом. Например, метаболические пути функционируют более эффективно, если субстраты для ферментативных реакций оказываются в соответствующем месте в нужное время. Исследование высокоочищенных ферментов в разбавленных растворах, где кинетика реакции соответствует уравнению Михаэлиса-Ментен, много дало для понимания их поведения в этих условиях. Однако большинство внутриклеточных ферментов никогда не функционирует в условиях, отвечающих уравнению Михаэлиса-Ментен, и обычно находится не в разбавленном растворе, а в сложной неоднородной среде (Тривен, 1983). Кроме того, в последние годы получено немало доказательств того, что многие ферменты в клетках работают в виде структурно и кинетически единых комплексов. В них проходит цепь последовательных процессов, когда продукт первого фермента является субстратом для второго фермента и т.д. (Березов, Коровкин, 1998). С этой точки зрения гораздо важнее исследовать функционирование не отдельно взятого фермента, а цепей сопряженных ферментативных реакций. Прямые исследования этих комплексов в клетке произвести трудно. Поэтому весьма актуальной для понимания процессов, происходящих в клетке, является создание моделей структурно и кинетически единых ферментативных комплексов, находящихся в соответствующем микроокружении.
Цель проекта – разработка и исследование экспериментальной модели для изучения функционирования цепей сопряжения ферментов внутри клетки на примере люминесцентной системы светящихся бактерий. В качестве физических моделей рассматриваются структуры, в которых сопряженная система НАДН:ФМН-оксидоредуктаза- люцифераза иммобилизуется в полимерные гели различной природы, либо помещается в условия повышенной вязкости, созданные ратворами сахарозы или глицерина.
Основная цель плана НИР второго этапа (2010 г.) работы над проектом состояла в разработке математической модели функционирования бактериальной биолюминесцентной системы in vivo на основе полученных в проекте экспериментальных данных.
Другой целью настоящего проекта являлось вовлечение молодежи в научную деятельность и построение образовательного процесса на основе новых научных результатов. Реализация этой цели осуществлялась на кафедры биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ (ИФБиБТ СФУ), возглавляемой руководителем настоящего проекта - проф., д.б.н. Кратасюк В.А.
Основная часть
Раздел 1 Разработка экспериментальных моделей функционирования биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза в вязком микроокружении 1.1 Выбор микроокружения для построения экспериментальной модели функционирования люциферазы в клетке
1.1.1 Экспериментальное изучение кинетических параметров работы ферментов в вязких растворах сахарозы и глицерина при изменении рН и температуры
Для понимания процессов поведения ферментативной люминесцентной системы светящихся бактерий в условиях близких к in vivo было изучено влияние специально подобранной гетерогенной среды на биферментную систему НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза. Оптимизация микроокружения была достигнута за счет подбора соответствующих реакционных сред, отличающихся концентрациями органических растворителей, которые повышают вязкость реакционной среды, - глицерин и сахароза.
Важный физико-химический параметр, который очень сильно влияет на активность биферментной биолюминесцентной системы — это рН. Влияние рН на интенсивность свечения биферментной биолюминесцентной системы изучено в условиях различной вязкости. Для измерения интенсивности биолюминесценции в зависимости от кислотности среды использовали различные значения рН: 5,8; 6,4; 6,9; 7,3; 7,8 и концентрации органических растворителей: сахарозы: 0,06 М; 0,51 М; 1,01 М; 2,03 М; 4,06 М и глицерина: 0,91 М; 1,09 М; 2,72 М; 5,43 М; 8,15 М. За контроль принимали значения кинетических параметр, полученных при значении рН = 6,9.
Показано, что органические растворители, которые повышают вязкость реакционной среды, - глицерин и сахароза ингибируют интенсивность свечения биолюминесценции при всех исследуемых значениях рН в разной степени.
Полученные зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации органических растворителей были охарактеризованы параметром С50 –пороговой концентрацией растворителя, при которой происходит потеря половины ферментативной активности. Экспериментально определенные значения С50 для органических растворителей составляет при рН=6.9 (контроль): для глицерина С50 = 6,65 М; для сахарозы С50=1,993 М (рис.1.1.1). Следовательно, более сильным ингибитором биферментной биолюминесцентной реакции по сравнению с глицерином является органический растворитель – сахароза.
1 – глицерин, 2 – сахароза
Рисунок 1.1.1 - Зависимость интенсивности свечения биолюминесценции (% ) от концентрации глицерина и сахарозы при рН=6.9.
Интенсивность свечения бактериальной биолюминесцентной реакции уменьшается с увеличением концентрации сахарозы при всех исследованных значениях рН. Изменение рН реакционной среды приводит к уменьшению интенсивности свечения по отношению к контролю при всех исследованных концентрациях, как сахарозы, так и глицерина. Наибольший инактивирующий эффект в присутствии сахарозы имеет рН реакционной среды 5,8 , тогда как в присутствии глицерина - рН равняется 7,84.
Анализ параметра С50, характеризующий инактивирующее действие органических растворителей на биферментную биолюминесцентную бактериальную систему (табл. 1.1.1.), в реакционных средах с различным значением рН показал, что более сильным ингибитором биферментной биолюминесцентной реакции является органический растворитель - сахароза, по сравнению с глицерином.
Исследование влияния вязкости реакционной среды, моделируемой введением различных концентраций сахарозы, на рН–оптимум биферментной бактериальной системы показало, что рН – оптимум реакционной среды для бактериальной биферментной биолюминесцентной реакции в фосфатном буфере, равный 6,9, не изменяется при варьировании вязкости реакционной среды путем введения сахарозы до 1,01 М ее содержания в реакционной среде.
Таблица 1.1.1
Параметр С50, характеризующий инактивирующее действие органических растворителей на биферментную биолюминесцентную бактериальную систему
С50, М
рН
|
Сахароза
|
Глицерин
|
5,8
|
0,30
|
7,29
|
6,4
|
1,93
|
6,53
|
6,9
|
2,70
|
8,10
|
7,3
|
1,53
|
7,57
|
7,8
|
1,21
|
7,80
|
Интенсивность свечения биферментной биолюминесцентной реакции уменьшается с увеличением концентрации сахарозы как щелочной, так и в кислой среде: в щелочной среде интенсивность свечения уменьшается с увеличением концентрации сахарозы на 24,2%; 38,1%; 67% и 83,3% для 1,01 М; 2,03 М и 4,06 М сахароза, соответственно, или не меняется (0,51 М); в кислой среде при рН = 5,8 значение интенсивности свечения биферментной биолюминесцентной системы уменьшается в среднем на 75 % для 0,51 М; 1,01 М; 2,03 М и 4,06 М концентраций сахарозы (рис. 1.1.2). В реакционной среде, содержащей 4,06 М сахарозы, рН–оптимума не было зарегистрировано.
Далее бала исследована зависимость интенсивности свечения биферментной биолюминесцентной системы от рН в условиях различной вязкости при использовании глицерина. Показано, что рН–оптимум реакционной среды для бактериальной биферментной биолюминесцентной реакции не изменяется при варьировании вязкости реакционной среды путем введении глицерина за исключением концентрации глицерина равной 8,15 М (рис. 1.1.3). В щелочной среде интенсивность свечения с увеличением концентрации глицерина 0,91 М; 1,09 М; 2,72 М; 5,44 М; 8,15 М уменьшается на 13,6%; 15,1 %; 22,9 %; 26,9 % и 56,3% , соответственно. В кислой среде значение интенсивности свечения биферментной биолюминесцентной системы с увеличением концентрации глицерина или увеличивается (0,91 М глицерина), или уменьшается на 29,2%; 44,8 %; 51,2 % и 62,3 % для 1,09 М; 2,72 М; 5,44 М; 8,15 М концентрации глицерина, соответственно.
1- контроль; 2- 0,06 М; 3- 0,51 М; 4- 1,01 М; 5- 2,03 М; 6-4,06 М сахароза
Рисунок 1.1.2 - Зависимость интенсивности свечения биферментной биолюминесцентной системы от рН в условиях различной вязкости.
1-0,91 М; 2- контроль; 3- 1,09 М; 4- 2,72 М; 5- 5,44 М; 6-8,15 М глицерина
Рисунок 1.1.3 - Зависимость интенсивности свечения биферментной биолюминесцентной системы от рН в условиях различной вязкости.
Органические растворители оказывают существенное влияние не только на интенсивность светоизлучения биферментной биолюминесцентной системы, но и на константу спада биолюминесценции (kcn), которая характеризует скорость распада долгоживущего интермедиата. Эксперименты показали, что присутствие возрастающих концентраций органических растворителей - сахарозы и глицерина, в реакционной среде биферментной биолюминесцентной системы приводит к стабилизации возбужденного интермедиата реакции (рис. 1.1.4). То есть, скорость распада фермент-субстратных комплексов монотонно изменяется с ростом доли органического компонента в реакционной среде: увеличивается с увеличением концентрации глицерина и сахарозы.
1 – сахароза, 2 – глицерин
Рисунок 1.1.4 - Зависимость константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при контроле (значении рН = 6,9) от концентрации сахарозы иглицерина.
Полученные результаты показали, что увеличение вязкости реакционной среды при введении, как глицерина, так и сахарозы приводит к уменьшению константы спада биолюминесценции, а значит, к увеличению времени жизни долгоживущего интермедиата биолюминесценой сопряженной системы, то есть к его стабилизации, причем в сахарозе стабилизация наблюдается в большой степени.
Зависимости константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при разном значении рН (6,9; 5,8; 6,4: 7,3; 7,8) от концентрации сахарозы представлены на рисунке 1.1.5.
Показано, что скорость распада долгоживущего интермедиата при всех исследованных значениях рН уменьшается на 10-15% с увеличением концентрации органического растворителя – сахарозы (рис.1.1.6), причем при рН в контроле наблюдаются минимальные значения константы спада биолюминесценции, то есть при рН 7,3 наблюдается максимальная стабилизация фермент-субстратного комплекса. При рН 6,4 наблюдаются максимальные значения константы спада биолюминесценции. Из рисунка 1.1.6 видно, что максимальное значение константы спада светоизлучения биферментной биолюминесцентной системы при всех используемых концентрациях глицерина наблюдается в контроле (значении рН 6,9). Константа спада биолюминесценции при рН реакционной системы равной 5,8; 6,4 и 7,3; 7,8 практически совпадает при всех используемых концентрациях глицерина.
1- 6,4; 2-5,8: 3- 7,84; 4- 7,3; 5- 6,9 (контроль)
Рисунок 1.1.5 - Зависимость константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы от концентрации сахарозы при разных значениях рН.
Таким образом, эксперименты показали, что присутствие возрастающих концентраций органических растворителей - сахарозы и глицерина, в реакционной среде биферментной биолюминесцентной системы приводит к стабилизации возбужденного интермедиата реакции. То есть, скорость распада фермент-субстратных комплексов монотонно изменяется с ростом доли органического компонента в реакционной среде: увеличивается с увеличением концентрации глицерина и сахарозы.
1- контроль; 2- 7,84: 3- 5,8; 4- 7,33; 5-6,39
Рисунок 1.1.6 - Зависимость константы спада биферментной биолюминесцентной системы при разном значении рН от концентрации глицерина.
Исследование влияния рН на квантовый выход биферментной биолюминесцентной системы в условиях различной вязкости квантовый выход с увеличением концентрации сахарозы уменьшается при всех значениях рН.
При значении рН реакционной среды для функционирования биферментной биолюминесцентной системы, равной 6,9, с увеличением концентрации сахарозы квантовый выход светоизлучения уменьшается незначительно (рис. 1.1.7), тогда как при рН 5,8 в реакционной среде квантовый выход биолюминесценции с увеличением концентрации сахарозы уменьшается на 60 % по сравнению с рН 5,8 в реакционной смеси без органического растворителя. Число квантов Q, испущенных в ходе реакции, при контроле выше приблизительно на 35 %, чем при рН 5,8.
При рН 6,4 значение Q биферментной биолюминесцентной системы ниже, чем в контроле. При значении рН равном 6,4 с увеличением концентрации сахарозы до 2,03 М (рис.1.1.7, кривая 2) квантовый выход биолюминесценции увеличивается приблизительно на 40% по сравнению с реакционной системой при рН 6,4 без сахарозы. При 4,06 М сахарозы квантовый выход уменьшается по сравнению с реакционной системой при рН 6,4 без сахарозы незначительно. Число испущенных квантов при рН 6,9 выше, чем при рН 6,4.
1- 6,4; 2- 5,8; 3- контроль; 4-7,8; 5-7,3
Рисунок 1.1.7 - Зависимость квантового выхода биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при разном значении от концентрации сахарозы при различных рН.
Значения Q биферментной биолюминесцентной системы в контроле и при рН 7,3 при малых концентрациях сахарозы от 0 М до 0,06 М совпадает, при дальнейшем повышении концентрации сахарозы квантовый выход биолюминесценции при рН 7,3 уменьшается значительно: при 4,00 М сахарозе квантовый выход составляет 15 % от контроля. Значения Q биферментной биолюминесцентной системы при рН 7,8 меньше, чем в контроле. При повышении концентрации сахарозы квантовый выход биолюминесценции при рН 7,8 уменьшается значительно по сравнению с контролем, приблизительно на 65 %. Таким образом, число испущенных квантов в ходе реакции в контроле выше, чем при рН 7,8.
Таким образом, квантовый выход биферментной биолюминесцентной реакции с увеличением концентрации сахарозы уменьшается при всех значениях рН. Изменение рН (как увеличение, так и уменьшение по отношению к контролю) приводит к уменьшению испускания квантов.
Квантовый выход биферментной биолюминесцентной системы при введении глицерина не изменяется в кислой среде и увеличивается в щелочной незначительно, по отношению к контролю (рис. 1.1.8).
1-6,9 (контроль); 2-6,4: 3-5,8; 4-7,3; 5-7,8
Рисунок 1.1.8 - Зависимость квантового выхода биолюминесценции
биферментной биолюминесцентной системы от концентрации глицерина при разных значениях рН.
Итак, увеличение вязкости реакционной среды биферментной биолюминесцентной реакции путем введения глицерина приводит к увеличению испускания числа квантов, тогда как введение сахарозы существенно не изменяет квантовый выход.
Таким образом, при изучении кинетических параметров биферментной биолюминесценой реакции при изменении вязкости и рН реакционной среды показано, что увеличение вязкости реакционной среды для биолюминесцентной биферментной бактериальной реакции приводит к уменьшению максимального значения интенсивности свечения и константы спада при различных значениях рН. Значения рН–оптимума изменяется при введении в реакционную смесь только высоких концентраций глицерина и сахарозы. Интенсивность свечения линейно уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды, как в глицерине, так и в сахарозе, и практически не зависит от природы используемого растворителя при нейтральном значении рН. Увеличение вязкости реакционной среды биферментной биолюминесцентной реакции путем введения глицерина приводит к увеличению испускания числа квантов, тогда как введение сахарозы существенно не изменяет квантовый выход. Сахароза является более сильным инактиватором биферментной биолюминесцентной системы по сравнению с глицерином.
Для подбора условий (рН, вязкость и другие физико-химические характеристики микроокружения ферментов биолюминесценой системы), при которых не происходит инактивации и термоинактивации биферментной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин и сохраняется высокая субстратная специфичность ферментов, что наилучшим образом отвечает условиям работы ферментов in vivo, были проведены эксперименты по изучению кинетических параметров бактериальной биолюминесцентной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин при разных температурах.
Исследование влияния вязкости среды на интенсивность свечения биферментной системы показало, что введение увеличивающихся концентраций сахарозы и глицерина в реакционную среду в конечном итоге приводит к уменьшению интенсивности свечения: при различных температурах реакционных смесей наблюдалась инактивация интенсивности свечения.
Показано, что температурный оптимум бактериальной биферментной системы не изменяется и находится в пределах 25°C - 26 °C при всех используемых концентрациях глицерина. Сама же интенсивность светоизлучения уменьшается с увеличением концентрации глицерина. Нормирование графиков зависимостей интенсивности свечения от концентрации глицерина позволяет оценить смещение температурного оптимума, а также изменение стабильности бактериальной биолюминесцентой биферментной системы при разных температурах в условиях различной вязкости. При всех используемых концентрациях глицерина нормированные зависимости интенсивности свечения от температуры совпадают, то есть увеличение вязкости реакционной среды при введении глицерина не приводит к изменению температурного профиля реакции, а значит и к заметным эффектам стабилизации или дестабилизации.
Зависимости интенсивности свечения от температуры практически совпадают, что свидетельствует о стабилизирующем эффекте сахарозы на биферментную систему в этом диапазоне температур: концентрация сахарозы растет, а активность остается на уровне контроля.
При проведении реакции при 170С увеличивающаяся вязкость среды, достигаемая путем введения сахарозы в реакционную смесь, оказывает существенное влияние на термостабильность биферментной системы. Термостабильность в этих условиях уменьшается с увеличением вязкости среды. При 170С температурный оптимум смещается в сторону более высоких температур на два градуса при 50%-ном содержании сахарозы в реакционной среде.
Интенсивность свечения биолюминесцентной реакции в присутствии сахарозы ингибируется в меньшей степени, чем при глицерине. Это также совпадает с результатами, полученными при изучении кинетики биферментной биолюминесцентной системы в присутствии этих эффекторов, которые также показали, что уменьшение максимальной скорости реакции на 50% происходит в более низких концентрациях сахарозы по сравнению с глицерином.
Далее были изучены зависимости константы спада биолюминесценции от температуры при различном содержании сахарозы и глицерина в реакционной среде.
Показано, что константа спада биолюминесцентной реакции kcn имеет рН-оптимум, который в буферном растворе равен 25 °С. Температурный оптимум смещается в сторону больших температур на 2-30С при 50% содержании как сахарозы, так глицерина в реакционной среде. Показано, что kcn максимальна в буферном растворе во всем исследуемом диапазоне температур, и уменьшается с увеличением содержания органического растворителя в реакционной среде.
Экспериментальные результаты показали, что возрастающие концентрации сахарозы и глицерина понижают константу спада во всем диапазоне исследуемых температур, причем возрастающие концентрации сахарозы в реакционной среде стабилизируют долгоживущий интермедиат реакции в большей степени по сравнению с глицерином. Следует заметить, что степень стабилизации долгоживущего интермедиата зависит от температуры реакционной среды. В большей степени увеличивающиеся концентрации как глицерина, так и сахарозы стабилизируют долгоживущей интермедиат при температурах, близких к температурному оптимуму: в этом случае значения константы спада минимальны при максимальном содержании сахарозы или глицерина. При, например, 420С уменьшение константы спада в 50 % глицерине происходит в меньшей степени. Особенно это хорошо видно из зависимостей константы спада биферментной биолюминесцентной системы от концентраций органических растворителей при различных температурах для глицерина и сахарозы. Кроме того, из этих зависимостей следует, что при увеличении концентрации глицерина для любой из исследуемых фиксированных температур наблюдается существенная (почти на порядок) стабилизация долгоживущего интермедиата. В присутствии сахарозы наблюдается аналогичный эффект, но степень стабилизации в 2 раза меньше.
Квантовый выход биферментной биолюминесцентной реакции зависит от изменения константы спада светоизлучения, и в меньшей степени определяется начальной скоростью реакции.
Увеличивающиеся концентрации, как глицерина, так и сахарозы уменьшают квантовый выход реакции, причем в глицерине это уменьшение наблюдается в большей степени, чем в сахарозе. 50 % содержание сахарозы в реакционной среде способствует большему количеству излучения квантов, чем такая же концентрация глицерина (рис. 1.1.9 и 1.1.10). Зависимость для квантового выхода биферментных биолюминесцентных систем от температуры также характеризуется температурным оптимумом, который не изменяется при увеличении концентрации как глицерина, так и сахарозы.
Рисунок 1.1.9 - Зависимость квантового выхода биферментной
биолюминесцентной системы от температуры при различных концентрациях глицерина.
Рисунок 1.1.10 - Зависимость квантового выхода биферментной биолюминесцентной системы от температуры при различных концентрациях сахарозы.
При сравнении абсолютных значений кинетических параметров биолюминесцентной биферментной реакции в вязких средах при увеличении температуры по отношению к оптимуму, можно сделать вывод, что при более высоких исследуемых температурах в диапазоне от 36,6 до 42 °C глицерин является более сильным ингибитором, чем сахароза. Температурный оптимум для биферментной биолюминесцентной системы равен 25°C и не зависит от вязкости среды в исследованных пределах.
Таким образом, в ходе экспериментального изучения кинетических параметров работы ферментов в вязких растворах сахарозы и глицерина и в буферном растворе с низкой вязкостью при изменении рН и температуры были получены следующие основные результаты:
1). Подобраны условия (рН, вязкость и другие физико-химические характеристики микроокружения ферментов биолюминесценой системы), при которых не происходит инактивации и термоинактивации биферментной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин и сохраняется высокая субстратная специфичность ферментов, что наилучшим образом отвечает условиям работы ферментов in vivo.
2). Получены результаты, которые позволят варьировать условиями реакционной среды (рН, вязкости и температуры) для увеличения интенсивности свечения и квантового выхода биолюминесцентной реакции, приводящие в конечном итоге к увеличению чувствительности биолюминесцентного анализа. В частности, исследование влияния вязкости и рН реакционной среды на биферментную биолюминесцентную бактериальную систему НАДH:ФМН-оксидоредуктаза- люцифераза показало, что увеличение вязкости реакционной среды для биолюминесцентной биферментной бактериальной реакции приводит к уменьшению максимального значения интенсивности свечения и константы спада при различных значениях рН, а значения рН–оптимума изменяются только в присутствии в реакционной среде высоких концентраций глицерина и сахарозы. Интенсивность свечения биолюминесценции линейно уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды, как в глицерине, так и в сахарозе, и практически не зависит от природы используемого растворителя при нейтральном значении рН. Увеличение вязкости реакционной среды биферментной биолюминесцентной реакции путем введения глицерина приводит к увеличению испускания числа квантов, тогда как введение сахарозы существенно не изменяет квантовый выход биолюминесценции. Показано, что сахароза является более сильным инактиватором биферментной биолюминесцентной системы по сравнению с глицерином в условиях температурного оптимума.
3). Была получена зависимость между термостабильностью биферментной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин и физико-химическими характеристиками микроокружения ферментов. Показано, что ЭМсахароза обладает большей термостабильностью по сравнению с моделью ЭМглицерин.
4). Предложены объемные пропорции компонентов реакционной среды, влияющих на активный центр люциферазы и характер связи субстратов с ферментом. В частности, в экспериментальной модели ЭМглицерин стабилизация возбужденного интермедиата происходит в большей степени при увеличении вязкости реакционной среды, чем в модели ЭМсахароза в широком диапазоне исследуемых температур (17-420С).
|
