Отчет по проекту №2 2/5309 «Моделирование процессов функционирования сопряженных ферментативных систем в клетке на примере ферментов светящихся бактерий» аналитической

1.1.4 Анализ влияния состава вязких сред на компоненты биолюминесцентной реакции методами флуоресцентной спектроскопии С целью моделирования работы биолюминесцентной биферментной системы в бактериальной клетке ранее было исследовано влияние на интенсивность биолюминесценции четырех вязких сред, содержащих глицерин, сахарозу, желатин и крахмал. Механизмы воздействия вязких сред различаются: от стимулирования свечения растворами желатина до ингибирования растворами глицерина или сахарозы. Однако вопрос о том, насколько тушение биолюминесценции связано непосредственно с вязкостью раствора остается открытым. Альтернативой ингибированию «по Крамерсу», характерному для ферментов, претерпевающих в ходе катализа существенные конформационные изменения (Uribe and Sampedro, 2003) является специфическое взаимодействие компонентов вязких сред с участниками биолюминесцентной реакции, что приводит к снижению их активности. Для обнаружения специфических взаимодействий со средой и конформационных изменений ферментов удобно использовать методы флуоресцентной спектроскопии, поскольку межмолекулярные взаимодействия отражаются на структуре электронно-возбужденных состояний молекул. Важнейшими компонентами биолюминесцентной реакции бактерий являются ферменты люцифераза и НАДН:ФМН-оксидоредуктаза и субстрат ФМН. Бактериальная люцифераза представляет собой -гетеродимер с молекулярной массой около 80 кДа, не содержащий металлов или кофакторов (Pocker and Janjic, 1990). Поэтому люминесцентные свойства данного фермента обусловлены содержащимися в его составе триптофановыми аминокислотными остатками. Согласно литературным данным бактериальные люциферазы содержат в своей аминокислотной последовательности 7-8 остатков триптофана. Спектр флуоресценции бактериальной люциферазы имеет максимум при 330 нм (Mejri et al., 1998). НАДН:ФМН-оксидоредуктаза представляет собой белок с молекулярной массой приблизительно 26 кДа. Молекула этого фермента содержит один триптофановый остаток в положении 212, находящийся близко к поверхности глобулы, и восемь тирозиновых остатков (Джеймс, 1980). Флавины обнаруживают интенсивную желто-зеленую флуоресценцию с максимумом при 520-530 нм (Kramers, 1940). Квантовый выход флуоресценции флавинов не зависит от длины волны возбуждения (в диапазоне 260-500 нм), что свидетельствует об очень высокой скорости внутренней конверсии и, как следствие, малых потерях энергии из-за излучения с высших состояний и интеркомбинационной конверсии. В растворителях, менее полярных, чем вода, максимум спектра испускания флавинов обычно сдвигается в коротковолновую область и частично разрешается структура колебательных подуровней. Уменьшение полярности растворителя приводит также к увеличению квантового выхода флуоресценции флавинов. При связывании с белками квантовый выход флуоресценции ФМН и его производных, как правило, значительно уменьшается (флавопротеины флуоресцируют слабо). Исключение составляют бактериальная люцифераза, люмазиновый апопротеин и желтый флуоресцентный белок (Джеймс, 1980). Целью данного этапа работы являлось исследование влияния состава вязких сред на спектрально-люминесцентные характеристики основных компонентов биолюминесцентной реакции бактерий – ФМН, бактериальной люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы. Спектры флуоресценции Были получены спектры люминесценции флавинмононуклеотида (ФМН), бактериальной люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы в присутствии разных концентраций глицерина, сахарозы, желатина и крахмала. Влияние сред на спектры флуоресценции описаны в таблице 1.1.4. Показано, что флуоресценция ФМН характеризуется максимумом при длине волны 530 нм. Положение максимума флуоресценции ФМН не подвержено влиянию ни одной из вязких сред, исследуемых в данной работе. Это свидетельствует о том, что для молекулы ФМН не происходит снижения полярности микроокружения (Fischer et al., 1996). С другой стороны, модифицированные вязкие среды влияют на интенсивность люминесценции ФМН, а значит на его квантовый выход флуоресценции. При этом установлено, что глицерин усиливает интенсивность люминесценции ФМН почти в 1,25 раза, а сахароза, напротив, ее тушит почти в 4 раза (таблица 1.1.4). Возможно, это связано с разными механизмами влияния компонентов сред на молекулы растворителя. Так, известно, что сахароза обладает способностью к структуризации молекул воды. В ее присутствии усиливаются водородные связи между молекулами растворителя и уменьшается их мобильность. Табл. 1.1.4. Влияние состава среды на спектрально-люминесцентные свойства компонентов биолюминесцентной системы: спектр флуоресценции (СФ) и анизотропию флуоресценции (АФ) при 20С. Компонент (концентрация) ФМН* (110-5 М) Бактериальная люцифераза# (110-6 М) НАДН:ФМН- оксидоредуктаза# (0,56 ед.акт/мл) Состав среды (диапазон концентраций) Фосфатный буфер (0,05 М) СФ: max=530 нм, Imax= 7 о.е. АФ: 0,005 СФ: max=330 нм, Imax= 7 о.е. АФ: 0,045 СФ: max=331 нм, Imax= 14,6 о.е. АФ: 0,053 Глицерин (10-80%) СФ: форма сохраняется, Imax увеличивается на 25% АФ: растет от 0,009 до 0,119 СФ: гипсохромный сдвиг на 5 нм, Imax уменьшается на 15% АФ: растет от 0,053 до 0,063 СФ: форма сохраняется, Imax уменьшается на 30% АФ: растет от 0,049 до 0,051 Сахароза (10-65%) СФ: форма сохраняется, Imax уменьшается на 75% АФ: растет от 0,018 до 0,301 СФ: форма сохраняется, Imax уменьшается на 50% АФ: растет от 0,058 до 0,072 СФ: гипсохромный сдвиг на 5 нм, Imax уменьшается на 59% АФ: растет от 0,073 до 0,087 Желатин (0,1-1%) СФ: форма сохраняется, Imax уменьшается на 16% АФ: растет от 0,008 до 0,014 СФ: форма сохраняется, Imax уменьшается на 63% АФ: растет от 0,062 до 0,085 СФ: форма сохраняется, Imax уменьшается на 72% АФ: растет от 0,059 до 0,077 Картофельный крахмал (0,5-5%) СФ: форма сохраняется, Imax уменьшается на 14% АФ: сохраняется 0,011 СФ: не изменяется АФ: растет от 0,048 до 0,059 СФ: не изменяется АФ: сохраняется 0,070 * Условия регистрации: длина волны возбуждения – 450 нм, длина волны регистрации – 530 нм, спектральная ширина щелей возбуждающего и регистрирующего монохроматоров – 4 нм. #Условия регистрации: длина волны возбуждения – 285 нм, длина волны регистрации – 335 нм, спектральная ширина щелей возбуждающего и регистрирующего монохроматоров – 4 нм. Известно, что глицерин оказывает обратное действие – он увеличивает подвижность молекул растворителя (Mejri, 1998), что по-видимому, и происходит в нашем случае. Желатин является наиболее изученным гелеобразующим веществом биологической природы. В отличие от других гелей он способен образовывать гель не только при охлаждении, но и в результате набухания в воде (Илларионов и др., 1988). Экспериментальные наблюдения показывают, что желатиновый гель представляет собой систему, к которой водородные связи и гидрофобные силы сбалансированы. Спектры бактериальной люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы характеризуется максимумами при длине волны около 330 нм. Следует заметить, что, согласно литературным данным (Lee, 1993), спектры флуоресценции триптофана в воде и глицерине имеют максимумы при 347 и 343 нм, соответственно. Это говорит о том, что большинство триптофановых остатков люциферазы и оксидоредуктазы находятся в неполярном окружении и спрятаны от растворителя внутри белковой глобулы. Зарегистрирован гипсохромный сдвиг приблизительно на 5 нм спектров флуоресценции люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы в растворе сахарозы и глицерина. В случае оксидоредуктазы такое изменение спектра свидетельствует о конформационном изменении фермента в среде, содержащей сахарозу. Направление сдвига указывает на уменьшение полярности окружения триптофанов оксидоредуктазы, что может быть результатом более плотной упаковки глобулы данного белка. Сдвиг спектра люциферазы может быть вызван как конформационными изменениями данного фермента, так и тушением флуоресценции части триптофановых остатков в ее составе. Для обоих ферментов сдвиг спектра сопровождается уменьшением интенсивности люминесценции. Не смотря на то, что при уменьшении полярности микроокружения следует ожидать увеличения квантового выхода флуоресценции триптофана (Tanner et al., 1996), полученные в данной работе результаты могут объясняться сближением триптофановых остатков с группами-тушителями в составе белков (например, с цистеиновыми остатками) (Демченко, 1988). Анизотропия флуоресценции Поляризация или анизотропия излучаемого флуорофором света может свидетельствовать о его скорости вращательной диффузии, а, следовательно, о вязкости микроокружения или взаимодействии с макромолекулами. При изучении закономерностей функционирования ферментов в вязких и особенно гелеобразных средах часто возникает проблема измерения величины микровязкости окружения, в котором протекают исследуемые реакции. Это вызвано тем, что макровязкость растворов биополимеров, измеряемая стандартным способом с помощью визкозиметра, определяется прежде всего размерами макромолекул, тогда как микровязкость зависит от взаимодействия небольших сегментов соседних молекул (Кузьмин и Кузьмина, 1987). С этой точки зрения более подходящим способом измерения микровязкости является флуоресцентный метод, основанный на явлении анизотропии флуоресценции. Среди реагентов биолюминесцентной реакции бактерий имеется флуоресцирующее в видимой области низкомолекулярное соединение, которое может играть роль естественного зонда на вязкость – это молекула ФМН. Калибровка данного зонда с помощью растворов глицерина и сахарозы описаны в п.1.3.5 отчета. Было получено значительное увеличение анизотропии флуоресценции ФМН в средах с высокой вязкостью (таблица 1.1.4, рис. 1.1.15). Рисунок 1.1.15 - Зависимость анизотропии флуоресценции ФМН от вязкости среды в присутствии разных концентраций глицерина и сахарозы. Величины анизотропии флуоресценции триптофановых остатков в составе исследованных ферментов варьируют в диапазоне 0,05-0,09 (рис.1.1.16). Низкая величина анизотропии флуоресценции белков, полученная в данной работе, говорит о малом вкладе в деполяризацию вращения белковой глобулы как целого (Демченко, 1988). Согласно литературным данным, даже для вращения триптофана в воде анизотропия флуоресценции приблизительно равна 0,14 (Lee, 1993). Поэтому, очевидно, низкая величина анизотропии флуоресценции люциферазы и оксидоредуктазы свидетельствует о сокращении излучательного времени жизни флуоресцентного состояния триптофанов в их составе. Не смотря на спрятанность триптофановых остатков внутри белковой глобулы, на которую указывает положение спектров люминесценции, их анизотропия флуоресценции чувствительна к вязкости среды. Это может быть следствием конформационных изменений ферментов, приводящих к увеличению локальной микровязкости окружения триптофанов и/или к сокращению времени жизни флуоресцентных состояний. Интересным фактом является относительно высокое значение анизотропии флуоресценции ферментов при сравнительно низких использованных концентрациях желатина. Также наблюдается отсутствие изменение анизотропии флуоресценции ФМН и редуктазы в средах, содержащих крахмал. Увеличившись при концентрации 0,5% до определенного предела по сравнению с буферным раствором, анизотропия этих веществ практически не меняется даже когда концентрация крахмала вырастает в 10 раз. Учитывая отсутствия изменений в спектрах компонентов в данном случае, можно предположить, что влияние на анизотропию флуоресценции ферментов в присутствии крахмала оказывает затруднение вращения белка как целого. Рисунок 1.1.16. Анизотропия флуоресценции ФМН, бактериальной люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы в разных средах. Таким образом, установлено, что компоненты вязких сред оказывают влияние, главным образом, на интенсивность флуоресценции ферментов и ФМН. Спектры флуоресценции белков свидетельствуют об экранировке триптофановых остатков в их составе белковой матрицей от полярных молекул растворителя. Зарегистрирован гипсохромный сдвиг приблизительно на 5 нм спектров флуоресценции люциферазы в растворе глицерина и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы в растворе сахарозы, что может быть вызвано конформационными изменениями данных белков. Полученное возрастание анизотропии флуоресценции ферментов с увеличением вязкости среды свидетельствует о том, что часть триптофановых остатков в их составе находится на поверхности и подвержена влиянию растворителя. Обнаружено, что наименьшее влияние при исследованных концентрациях на компоненты биолюминесцентной реакции оказывает картофельный крахмал.

Похожие:

	Тема: Ферменты как биологичексие катализаторы. Кинетика ферментативных реакций Цель: Установить основные принципы обнаружения ферментов в биологических объектах (на примере амилазы и уреазы). Ознакомиться с основными...		Реферат Разработка метода оценки физического состояния спортсменов... Разработка метода оценки физического состояния спортсменов с использованием биолюминесцентной системы светящихся бактерий
	Метаболизм: фазы и стадии. Общий путь катаболизма Формирование представлений о метаболизме как совокупности взаимосвязанных ферментативных реакций в клетке, специфических и общей...		Рабочая программа моделирование транспортных процессов направление... Моделирование транспортных процессов: рабочая программа / авт сост. В. Б. Вилков, спб.: Ивэсэп, 2013. – 21 с
	Агентно-ориентированное моделирование поведения сложных систем в среде интернет Представлена реализация среды моделирования на основе системы моделирования дискретных событий, позволившая комплексировать агентно-ориентированное...		Математическое моделирование экономических систем «Основы математического моделирования экономических систем» должно способствовать развитию у студентов более глубокого понимания...
	Примерной программы дисциплины Компьютерное моделирование систем... Срс) различного назначения, в том числе систем мобильной связи (смс) и систем радиодоступа (срд), а также обеспечить развитие...		Рабочая программа по дисциплине опд. Ф. 08 Моделирование и оптимизация... Курс «Моделирование и оптимизация технологических процессов» является прикладной наукой, занимающейся вопросами моделирования рациональных...
	Рабочая программа по дисциплине опд. Ф. 08 Моделирование и оптимизация Курс «Моделирование и оптимизация технологических процессов» является прикладной наукой, занимающейся вопросами моделирования рациональных...		Отчет по проекту №38: Разработка рекомендаций по реализации Болонского... Программы: Научно-методическое обеспечение функционирования и модернизации системы образования
	Квантово-химическое моделирование нелинейно-оптических характеристик... Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте органической и физической химии		Тема Бактерии Бактерии. Многообразие бактерий. Строение и жизнедеятельность бактерий. Размножение бактерий
	Нормальная физиология Обучение системному подходу в процессе изучения физиологических механизмов и процессов, лежащих в основе функционирования органов...		Программа научного семинара " Моделирование и оптимизация бизнес процессов " Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов направления 080500. 68 Бизнес-информатика...
	Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину,...		Рабочая программа учебной дисциплины проектирование информационных... Целью дисциплины является: изучение методологии структурного анализа, моделирование информационных систем в стандарте idef, проектирование...