Отчет по проекту №2 2/5309 «Моделирование процессов функционирования сопряженных ферментативных систем в клетке на примере ферментов светящихся бактерий» аналитической
Скачать 2.25 Mb.
|
1.1.2 Анализ кинетических параметров работы ферментов в растворах разной вязкости и сравнение с аналогичными показателями в клеткахСовременным и перспективным методом оценки стабильности (устойчивости) биологической активности биопрепаратов различной природы при их длительном хранении является ускоренный изотермический тест на термостабильность при повышенных температурах, который позволяет количественно оценивать их стабильность и прогнозировать сроки хранения в зависимости от температуры. Нами предпринята попытка использования этого метода для прогноза сроков хранения люциферазы в водно-органических смесях. Предлагаемый метод предполагает проведение люциферазной реакции при повышенных температурах. Простейшая модель термоинактивации предполагает, что молекулы активного центра фермента (Еа) претерпевают необратимые структурные и химические изменения, приводящие к неактивной форме (Еi): Еа → Еi (1) Скорость приведенного выше процесса можно представить в виде дифференциального уравнения первого порядка: dEa --- = - k Ea dt или ln(Ea(t)) = ln(Ea(0)) - kt, (2) где k - константа скорости инактивации,c, t - время, мин. Константа скорости инактивации и энергия активации связанным уравнением Аррениуса: k = ko·exp(E/RT), (3) где R = 1,987 кал/(град·моль). Если известны константы скорости инактивации для двух разных температур, которые получают из анализа изменения активности фермента в определенного течение времени, то можно получить значения k для любой температуры на основании этого уравнения. Полученные нами зависимости активности буферного раствора люциферазы при различных температурах от времени носят линейный характер и описываются уравнением вида y=a+kx, где k=tga=ln(Ea(t))/t и а - угол наклона прямой. Статистические данные температурной денатурации люциферазы в буферном растворе приведены в таблице 1.1.2. Из них можно заключить, что, как и было показано ранее, при разных температурах инактивация люциферазы происходит по экспоненциальному закону и полностью описывается константой скорости мономолекулярной реакции превращения фермента в неактивную форму. Возрастание температуры инкубации приводит к увеличению константы инактивации фермента. Для исследования влияния вязкости на термостабильность люциферазы были выбраны два растворителя с высокими пороговыми концентрациями: диметилсульфоксид (ДМСО), который слабо меняет вязкость реакционной среды, и глицерин. Экспериментальные данные получены для смесей с содержанием органического компонента меньше порогового значения. Такой выбор концентраций органических растворителей основан на предположении, что белок необратимо теряет свою нативную форму при достижении пороговой концентрации. Зависимости ln I от времени инкубации в буферно-глицериновых растворах люциферазы для 400 С и 420 С достоверно отличаются от контроля. Зависимости lnI(t) носят линейный характер и описываются уравнением вида y=a+bх. Графики, описывающие зависимости для буферно-глицеринового раствора люциферазы при выбранных нами температурах, проходят значительно выше соответствующих контролей. Значит, глицерин оказывает стабилизирующее действие на термоинактивацию люциферазы. Статистические данные ингибирующего действия температуры и органических растворителей (12,5%ГЛ и 5%ДМСО) на люциферазу представлены в табл. 1.1.3. Табл. 1.1.2. Статистические данные термоинактивации люциферазы в буферном растворе
где r - коэффициет корреляции, а=ln (Еа(0)). В экспериментах по изучению влияния 5% DMSO, добавляемого в буферный раствор фермента, на термостабильность люциферазы ферментативную реакцию проводили при 400 С и 420 С. Буферный и водно-органический растворы фермента во время проведения измерений находились при этих же температурах. Полученные в результате опыта зависимости ln I от времени для DMSO аналогично контролю носят линейный характер. С увеличением времени инкубации происходит уменьшение ферментативной активности; и чем выше температура инкубации, тем быстрее происходит термоинактивация. Легко сделать вывод об ингибирующем действии DMSO на люциферазу, сравнив термоинактивацию контроля при 400 С и 420 С и термоинактивацию фермента в присутствии 5% DMSO в реакционной смеси при этих же температурах: значения ln I в присутствии DMSO с течением времени убывают быстрее, чем значения ln I для контроля при одной и той же температуре. Ингибирующее действие DMSO на активность люциферазы наблюдается при проведении ферментативной реакции при 360 С , где в качестве водно-органического компанента использовали 12.5% DMSO. В результате эксперимента получены достоверно отличающиеся значения ln I при контроле от значений ln I для водно-органических растворов фермента. Аналогичные результаты получены и для 2.5%,7.5%,12.5% ДМСО при 400 С. Табл.1.1.3. Статистические данные совместного ингибирования люциферазы органическими растворителями и температурой
Из приведенных данных видно, что термоинактивация люциферазы в водно-органических смесях происходит аналогично термоинактивации контроля. Глицерин стабилизирует люциферазу против повышенных температур, а ДМСО, в комплексе с температурой, инактивирует люциферазу, поэтому ускоренный изотермический тест имеет смысл применить для водно-глицериновых смесей. Из табл. 1.1.3. возьмем значения k для контроля и 12.5% глицерина при 400 и 420 С. Графики зависимостей lnk(1/T), где Т - температура, выраженная в Кельвинах (К) y=a+kx, причем прямая для глицерина проходит выше прямой для контроля. Из полученного графика можно определить время сохранения активности люциферазы в 12.5% глицерине по сравнению с 0,02 М фосфатным буфером при разных температурах. Пусть Т=400 С. Из полученного нами графика найдем значения kк=0,086 мин и kgl=0,042 мин. В уравнении у=kt+а, а=lnIo=ln100=4,61, а у=lnIt=lnO=1. Зная k для контроля и глицерина легко найти время хранения t=3,6/k: tк=41,9 мин, tgl=85,8 мин. Найдем коэффициент стабилизации q=kк/kgl=0,5. Итак, глицерин защищает люциферазу против термоинактивации при повышенных температурах и, согласно ускоренному изотермическому методу, должен стабилизировать фермент при хранении. ДМСО не защищает люциферазу от действия высоких температур. Таким образом, в результате проведенных исследований были измерены параметры термоинактивации ферментов в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин. Предложен способ описания кинетики процесса и механизмов термической инактивации ферментов в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин для различных водно-органических сред на основе корреляционного анализа между энергией активации при различных температурах и физико-химическими характеристиками органических растворителей (logP, диэлектрическая проницаемость, вязкость и др.). Полученные результаты необходимы для оценки соответствия характеристик изучаемых экспериментальных моделей условиям функционирования ферментов в клетке. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | Тема: Ферменты как биологичексие катализаторы. Кинетика ферментативных реакций Цель: Установить основные принципы обнаружения ферментов в биологических объектах (на примере амилазы и уреазы). Ознакомиться с основными... |  | Реферат Разработка метода оценки физического состояния спортсменов... Разработка метода оценки физического состояния спортсменов с использованием биолюминесцентной системы светящихся бактерий |
| Метаболизм: фазы и стадии. Общий путь катаболизма Формирование представлений о метаболизме как совокупности взаимосвязанных ферментативных реакций в клетке, специфических и общей... | | Рабочая программа моделирование транспортных процессов направление... Моделирование транспортных процессов: рабочая программа / авт сост. В. Б. Вилков, спб.: Ивэсэп, 2013. – 21 с |
| Агентно-ориентированное моделирование поведения сложных систем в среде интернет Представлена реализация среды моделирования на основе системы моделирования дискретных событий, позволившая комплексировать агентно-ориентированное... | | Математическое моделирование экономических систем «Основы математического моделирования экономических систем» должно способствовать развитию у студентов более глубокого понимания... |
| Примерной программы дисциплины Компьютерное моделирование систем... Срс) различного назначения, в том чис ле систем мобильной свя зи (смс) и систем радиодоступа (срд), а так же обес пе чить раз ви тие... | | Рабочая программа по дисциплине опд. Ф. 08 Моделирование и оптимизация... Курс «Моделирование и оптимизация технологических процессов» является прикладной наукой, занимающейся вопросами моделирования рациональных... |
| Рабочая программа по дисциплине опд. Ф. 08 Моделирование и оптимизация Курс «Моделирование и оптимизация технологических процессов» является прикладной наукой, занимающейся вопросами моделирования рациональных... | | Отчет по проекту №38: Разработка рекомендаций по реализации Болонского... Программы: Научно-методическое обеспечение функционирования и модернизации системы образования |
| Квантово-химическое моделирование нелинейно-оптических характеристик... Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте органической и физической химии | | Тема Бактерии Бактерии. Многообразие бактерий. Строение и жизнедеятельность бактерий. Размно жение бактерий |
| Нормальная физиология Обучение системному подходу в процессе изучения физиологических механизмов и процессов, лежащих в основе функционирования органов... | | Программа научного семинара " Моделирование и оптимизация бизнес процессов " Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов направления 080500. 68 Бизнес-информатика... |
| Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину,... | | Рабочая программа учебной дисциплины проектирование информационных... Целью дисциплины является: изучение методологии структурного анализа, моделирование информационных систем в стандарте idef, проектирование... |
