Отчет по проекту №2 2/5309 «Моделирование процессов функционирования сопряженных ферментативных систем в клетке на примере ферментов светящихся бактерий» аналитической
Скачать 2.25 Mb.
|
1.2.2 Влияние физических и химических факторов на активность растворимой и иммобилизованной биферментной системы НАДН:ФМН- оксидоредуктаза – люциферазаПоказано, что иммобилизация изменяет свойства ферментов, в том числе зависимость каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, влияет на стабильность ферментов по отношению к денатурирующим воздействиям различного рода. На рисунке 1.2.2 представлена рН-зависимость интенсивности свечения биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза- люцифераза. Видно, что рН-оптимум растворимых ферментов составлял 6,8, при этом для всех иммобилизованных ферментов наблюдался сдвиг рН-оптимума в щелочную область. В то же время, для иммобилизованной в крахмальный гель биферментной системы интенсивность свечения составляла не менее 80% по отношению к максимуму активности во всем рассмотренном диапазоне значений рН, а рН-оптимум находился в диапазоне от 5,8 до 7,8. Для многокомпонентного реагента, иммобилизованного в желатиновый гель, рН-оптимум был более узким и располагался в диапазоне рН 6,6 - 7,3.  1 - растворимые R+L; 2 - R+L, иммобилизованные в крахмальный гель; 3 - R+L, иммобилизованные в крахмальный гель совместно с НАДН и альдегидом; 4 - R+L, иммобилизованные в желатиновый гель; 5 - R+L, иммобилизованные в желатиновый гель совместно с НАДН и альдегидом Рисунок 1.2.2 - рН - зависимость нормированной интенсивности свечения биферментной системы светящихся бактерий:. Подобное влияние рН на активность иммобилизованных ферментов можно объяснить несколькими причинами. Во-первых, заряженные группы носителя для иммобилизации могут влиять на распределение протонов в микроокружении иммобилизованных ферментов. Этот эффект должен быть заметным для ферментов, иммобилизованных в желатиновый гель, имеющий заряженные группы. В случае иммобилизации ферментов в крахмальный гель слабая зависимость активности биферментной системы от рН объясняется электронейтральностью носителя. Во-вторых, полимерная матрица, увеличивая вязкость среды, препятствует свободной диффузии протонов внутри иммобилизованного фермента и тем самым вызывает существенное изменение рН–зависимости активности, что особенно заметно с возрастанием рН, т.е. при уменьшении концентрации протонов в растворе. Кроме того, возможно сочетание эффектов распределения протонов и ограничения их диффузии. Расширение рН–оптимума для многокомпонентного иммобилизованного реагента, вероятно, обусловлено дополнительной стабилизацией молекул ферментов вследствие встраивания субстратов в активные центры ферментов в процессе иммобилизации. Нами также исследовано действие температуры на активность биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза. Иммобилизованные препараты ферментов сохраняли высокую каталитическую активность при действии температур во всем рассмотренном диапазоне. Для препаратов ферментов, иммобилизованных в крахмальный гель, интенсивность свечения составляла не менее 60% от максимальной, а для препаратов ферментов, иммобилизованных в желатиновый гель, - не менее 50% (рис. 1.2.3).  1 - растворимые R+L; 2 - R+L, иммобилизованные в крахмальный гель; 3 - R+L, иммобилизованные в крахмальный гель совместно с НАДН и альдегидом; 4 - R+L, иммобилизованные в желатиновый гель; 5 - R+L, иммобилизованные в желатиновый гель совместно с НАДН и альдегидом. Рисунок 1.2.3 - Зависимость нормированной интенсивности свечения биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктазы-люциферазы от температуры инкубирования. Для растворимой биферментной системы при инкубировании в диапазоне температур от 15 до 300С сохранялось не менее 60% активности от максимальной, в то время как полная инактивация ферментов происходила уже при температуре 400С. Для растворимой биферментной системы температурный оптимум активности, при котором интенсивность свечения препаратов ферментов была максимальной, находился в пределах 20-250С. Для иммобилизованных ферментов и ферментов, иммобилизованных совместно с тетрадеканалем и НАДН, наблюдалось расширение температурного оптимума: для препаратов, иммобилизованных в крахмальный гель, до диапазона 5-500С, для препаратов, иммобилизованных в желатиновый гель, - до 15-500С. Увеличение термостабильности ферментов при их иммобилизации объясняется уменьшением подвижности ферментов и их субъединиц в матриксе геля. Таким образом, иммобилизация в полимерные гели приводит к стабилизации биферментной системы, однако эффект стабилизации уменьшается при увеличении температуры. Эффективные значения энергии активации (Ed) для растворимой и иммобилизованной биферментной системы представлены в таблице 1.2.2. Таблица 1.2.2. Значения Ed (кДж/M) для биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза- люцифераза
Из таблицы 1.2.2 видно, что значения энергии активации для иммобилизованных ферментов меньше по сравнению с энергией активации растворимых ферментов. По-видимому, в случае иммобилизованных препаратов ферментов не наблюдается больших изменений свободной энергии по причине ужесточения конформации белков и ограничения их подвижности в иммобилизованном состоянии. Таким образом, образовавшийся в процессе иммобилизации комплекс белок-матрица, термодинамически становится более выгодным. Значения энергии активации для многокомпонентных систем оказываются больше, чем для ферментов, иммобилизованных без субстратов, в случае как крахмального, так и желатинового гелей. Это означает, что совместная иммобилизация ферментов и субстратов не приводит к дополнительной стабилизации ферментов, что выявляется в экспериментах по термоинактивации. Среди рассмотренных реагентов самой термодинамически стабильной является биферментная система, иммобилизованная в крахмальный гель, поскольку она характеризуется наименьшей энергией активации. При сравнении свойств ферментов, иммобилизованных в гели разной природы, выяснилось, что при использовании желатинового геля выход активности существенно ниже, а значения Km каж для ФМН и НАДН и величина энергии активации более высокие, чем в случае крахмального геля. Так как единственным отличием в условиях иммобилизации биферментной системы была природа используемого геля, то это, на наш взгляд, в первую очередь связано с различиями в физико-химических характеристиках и природе гелеобразующих полимеров. Крахмальный гель является химически нейтральным, и сохранение в нем высокой активности ферментов, вероятно, объясняется отсутствием ковалентных связей с активными группами включенных в него ферментов. В отличие от крахмала, желатин является полипептидом, содержащим значительное количество как полярных аминокислотных остатков (например, глицин и гидроксипролин, составляющие 30-35% и 10 % от общего состава аминокислотных остатков), так и гидрофобных аминокислотных остатков (например, пролин и аланин, каждый из которых составляет более 10 % от общего состава аминокислотных остатков) (Джеймс, 1980), которые способны образовывать водородные, гидрофобные и другие связи с молекулами оксидоредуктазы и люциферазы. Кроме того, в процессе студнеобразования между -цепями, формирующими молекулы желатина, происходит образование множества вторичных поперечных связей (преимущественно водородных), а также формируются коллагено-подобные спиральные конгломераты между несколькими цепями полипептидов (Джеймс, 1980). Так как включение ферментов в желатиновый гель проводится непосредственно в момент студнеобразования, это, по-видимому, может привести к частичной деформации конформации белков и, как следствие этого, к снижению их активности. Итак, при сравнении кинетических и термодинамических характеристик растворимой и иммобилизованной в полимерные гели биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза было показано, что иммобилизация в крахмальный и желатиновый гели приводит к значительной стабилизации биферментной системы по отношению к денатурирующим воздействиям при сохранении высокой активности ферментов, что указывает на возможность получения стабильного и высокоактивного реагента для биолюминесцентного анализа с использованием этих методов. Таким образом, показано, что экспериментальная модель ЭМкрахмал имеет лучше характеристики чем ЭМжелатин. Однако при использовании других типов желатина возможно найти условия, в которых бы желатиновая модель имела преимущества. 1.3 Разработка 4 прототипов экспериментальных моделей функционирования ферментов внутри клетки. Для решения фундаментальной задачи понимания механизмов сопряжения и функционирования ферментативных метаболических цепей в клетке создано несколько вариантов экспериментальных моделей (ЭМ), в которых реконструирована цепь сопряжения двух ферментов светящихся бактерий (люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы) в микроокружении, отличающемся разной вязкостью. Разработаны следующие прототипы экспериментальных моделей: 1).ЭМсахароза. Биферментная система НАДН:ФМН-оксидоредуктаза – люцифераза осуществляется в среде, вязкость которой меняется в зависимости от содержания сахарозы. 2).ЭМглицерин. Биферментная система НАДН:ФМН-оксидоредуктаза- люцифераза осуществляется в среде, вязкость которой меняется в зависимости от содержания глицерина. 3).ЭМкрахмал. Биферментная система НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза одна или вместе с субстратами и другими необходимыми для биолюминесценции компонентами иммобилизована в крахмальный гель. 4).ЭМжелатин. Биферментная система НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза иммобилизована в желатиновый гель вместе с субстратами и другими необходимыми для биолюминесценции компонентами. В моделях имитируется вязкое микроокружение ферментов в матриксе путем введения растворов сахарозы и глицерина, а также связь с мембранными структурами путем иммобилизации в крахмальный и желатиновый гели. Оценку эффективности каждой модели проводили, измеряя активность биолюминесцентной биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза –люцифераза. Для всех четырех типов экспериментальных моделей проведено исследование характеристик биолюминесценции биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, функционирующей в условиях различной вязкости, и биферментной системы, иммобилизованной в гели различных концентраций. Для обеспечения различных условий микроокружения использовались растворы сахарозы, глицерина, желатина и крахмала различных концентраций, что позволяло создавать микроокружение для ферментов с наперед заданными физико-химическими свойствами (гидрофобность, диэлектрическая проницаемость, вязкость, донорно-акцепторные свойства и др.). Полученные экспериментальные результаты позволяют выявить слабые и сильные стороны каждой из экспериментальных моделей и провести усовершенствование экспериментальных моделей, в том числе и с подключением методов математического моделирования, что в конечном итоге необходимо для выяснения разницы в условиях функционирования люциферазы в клетке и в растворе. В работе проводили выбор оптимального соотношения компонентов биолюминесцентных реакций в 4 прототипах экспериментальных моделей (ЭМглицерин, ЭМсахароза, ЭМкрахмал, ЭМжелатин), позволяющих улучшить характеристики биолюминесцентной биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза по сравнению с растворимыми системами. Были проведены следующие исследования: Исследованы кинетические параметры биолюминесцентной биферментной системы при варьировании вязкости реакционной среды путем введения в реакционную смесь органических растворителей (глицерина и сахарозы) или гелевых растворов разной природы (крахмального и желатинового); Исследованы кинетические параметры биолюминесценции биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза при варьировании вязкости и pH реакционной среды. Изучено влияние температуры на кинетические параметры биферментного комплекса в условиях различной вязкости. 1.3.1 Подбор условий оптимизации экспериментальных моделей ЭМглицерин и ЭМсахароза Оптимизация микроокружения для биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза была достигнута за счет подбора соответствующих реакционных сред, отличающихся концентрациями органических растворителей, а также за счет вариьрования таких физико-химических характеристик реакционной среды как температура и рН в условиях различной вязкости. Для достижения поставленной цели исследовалось влияние глицерина и сахарозы на кинетические параметры сопряженной ферментной системы НАД(P)H:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза при направленном изменении физико-химических характеристик реакционной среды. Показано, что органические растворители, которые повышают вязкость реакционной среды, - глицерин и сахароза ингибируют интенсивность свечения биолюминесценции при всех исследуемых значениях рН, но в разной степени. Интенсивность свечения бактериальной биолюминесцентной реакции уменьшается с увеличением концентрации сахарозы при всех исследованных значениях рН. Изменение рН реакционной среды приводит к уменьшению интенсивности свечения по отношению к контролю при всех исследованных концентрациях как сахарозы, так и глицерина. Наибольший инактивирующий эффект в присутствии сахарозы имеет рН реакционной среды 5,8, в присутствии глицерина - 7,84. На рисунках 1.3.1 – 1.3.4 представлены зависимости интенсивности свечения биферментной биолюминесцентной системы при значениях рН = 5,8; 6,4; 6,9; 7,3; 7,8 от вязкости, различные значения которой получены путем введения органических растворителей: глицерина и сахарозы (используемые концентрации органических растворителей: сахарозы: 0,06 М; 0,51 М; 1,01 М; 2,03 М; 4,06 М и глицерина: 0,91 М; 1,09 М; 2,72 М; 5,43 М; 8,15 М).  1- глицерин; 2- сахароза Рисунок 1.3.1 - Зависимость интенсивности свечения биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН = 5,8 от вязкости реакционной среды. Интенсивность свечения, которая характеризует скорость ферментативной биолюминесцентной реакции, при значении рН 5,8 линейно уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды при введении глицерина в реакционную среду (рис. 1.3.1, прямая 1), тогда как при использовании сахарозы для достижения аналогичных значений вязкости в реакционной среде зависимость интенсивности свечения от вязкости не является линейной (рис. 1.3.1, кривая 2). Зависимости интенсивности биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы от вязкости реакционной среды для сахарозы и глицерина, не совпадают: значения интенсивности свечения в глицерине значительно выше по сравнению с этими же параметрами при той же самой вязкости в сахарозе. Таким образом, при рН 5,8 реакционной среды увеличение вязкости реакционной среды для биолюминесцентной биферментной реакции приводит к уменьшению интенсивности свечения биферментной биолюминесцетной бактериальной реакции как в глицерине, так и сахарозе. Результаты показали, что природа растворителя является важным фактором, определяющим изменение интенсивности свечения биолюминесценции, поскольку эти растворители не только в разной степени оказывают ингибирующее действие на активность сопряженной биолюминесцентной ферментативной системы, но и характер этого ингибирования существенно отличается (глицерин линейно уменьшает интенсивности свечения, тогда как сахароза – нет) при значении рН 5.8. Из рисунка 1.3.1 видно, что при рН 5,8 реакционной среды сахароза является более сильным ингибитором по сравнению с глицерином. В свою очередь глицерин является лучшим стабилизатором по сравнению с сахарозой при увеличении вязкости реакционной среды до значения 4 мПа∙с. На рисунке 1.3.2 представлена зависимость интенсивности свечения биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН = 6,4 от вязкости реакционной среды. Интенсивность свечения при рН 6.4 линейно уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды, как при введении органического растворителя глицерина, так и сахарозы (рис. 1.3.2). Зависимости интенсивности биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы от вязкости реакционной среды для сахарозы и глицерина не совпадают: значения интенсивности свечения в сахарозе значительно выше по сравнению с этими же параметрами при той же самой вязкости в глицерине, но сахароза лучше предохраняет биферментную биолюминесцентную систему от инактивации по сравнению с глицерином при увеличении вязкости реакционной среды во всем измеренном диапазоне значений вызкости. Результаты показали, что при рН 6,4 природа растворителя является важным фактором, определяющим изменение интенсивности свечения биолюминесценции. Интенсивность свечения, которая характеризует скорость ферментативной биолюминесцентной реакции, линейно уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды, как при введении органического растворителя - глицерина, так и сахарозы (рис. 1.3.3) в стандартных условиях (при рН 6.9) также. Зависимости интенсивности биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы от концентрации как сахарозы, так и глицерина, практически совпадают: значения интенсивности свечения находятся в пределах ошибки измерения. Таким образом, при нейтральных значениях pH реакционной среды природа растворителя не является фактором, определяющим изменение интенсивности биолюминесценции. Таким образом, интенсивность свечения линейно уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды, как в глицерине, так и в сахарозе, и практически не зависит от природы используемого растворителя при нейтральном значении рН.  1- сахароза; 2- глицерин Рисунок 1.3.2 - Зависимость интенсивности свечения биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН = 6,4 от вязкости реакционной среды. На рисунке 1.3.4 представлена зависимость интенсивности свечения биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН 7,3 от вязкости реакционной среды. Интенсивность свечения ферментативной биолюминесцентной реакции линейно уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды, как при введении глицерина, так и сахарозы (рис. 1.3.4). Зависимости интенсивности биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы от концентрации как сахарозы, так и глицерина, практически совпадают: значения интенсивности свечения находятся в пределах ошибки измерения. Таким образом, при рН 7,3 увеличение вязкости реакционной среды для биолюминесцентной биферментной реакции является важным физико-химическим фактором, изменение интенсивности свечения линейно уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды, как в глицерине, так и в сахарозе, и не зависит от природы используемого растворителя при этом значении рН  1- сахароза; 2- глицеринРисунок 1.3.3 - Зависимость интенсивности свечения биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН 6,9 от вязкости реакционной среды. .  1- сахароза; 2- глицерин Рисунок 1.3.4 - Зависимость интенсивности свечения биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН = 7,3 от вязкости реакционной среды. Аналогичные результаты получены и при pH 7,9 реакционной среды для бактериальной биолюминесценой реакции. Таким образом, интенсивность свечения уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды как в глицерине, так и в сахарозе, и практически не зависит от природы используемого растворителя при больших значения рН, начиная с нейтрального рН. Максимальный ингибирующий эффект при всех значениях вязкости для всех исследуемых концентрациях сахарозы и глицерина наблюдается при рН=5.8. Остальные исследуемые значения рН вносят незначительный вклад в ингибирование биолюминесценции в диапазоне значений вязкости не превышающим 4 мПа∙с. Органические растворители оказывают существенное влияние не только на интенсивность светоизлучения биферментной биолюминесцентной системы, но и на константу спада биолюминесценции (kcn), которая характеризует скорость распада долгоживущего интермедиата. На рисунках 1.3.5 – 1.3.7 представлены зависимости константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при рН 5,8; рН 6,4; рН 6,9; рН 7,3; рН 7,8 от вязкости, различные значения которой получены путем введения органических растворителей: глицерина и сахарозы (используемые концентрации органических растворителей: сахарозы: 0,06 М; 0,51 М; 1,01 М; 2,03 М; 4,06 М и глицерина: 0,91 М; 1,09 М; 2,72 М; 5,43 М; 8,15 М). Рисунок 1.3.5 представляет зависимость константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной реакции при рН 5.8 от вязкости реакционной среды, из которого видно, что при одних и тех же значениях вязкости реакционной среды и фиксированном значении рН, константа спада биолюминесценции имеет отличающиеся значения в глицерине и сахарозе, что говорит о существенном влиянии природы растворителя на этот кинетический параметр. Согласно результатам, представленным на рис. 1.3.5 показано, что присутствие возрастающих концентраций органических растворителей - сахарозы и глицерина - в реакционной среде биферментной биолюминесцентной системы при рН 5.8 приводит в конечном итоге к стабилизации возбужденного интермедиата реакции. То есть, скорость распада фермент-субстратных комплексов монотонно изменяется с ростом доли органического компонента в реакционной среде: увеличивается с увеличением концентрации глицерина и сахарозы, но в разной степени.  1 - сахароза; 2- глицерин Рисунок 1.3.5 - Зависимость константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной реакции при значении рН = 5.8 от вязкости реакционной среды. Следует отметить, что сахароза оказывает небольшой активирующий эффект на константу спада биолюминесценции при значении вязкости 3 мПа.с (рис. 1.3.5, кривая 1). В глицерине же уменьшение константы спада происходит по линейному закону (рис. 1.3.5, прямая 2). Полученные результаты показали, что при рН 5.8 увеличение вязкости реакционной среды при введении как глицерина, так и сахарозы приводит к уменьшению константы спада биолюминесценции, а значит, к увеличению времени жизни долгоживущего интермедиата биолюминесцентной сопряженной системы, то есть к его стабилизации, причем в глицерине стабилизация наблюдается в большой степени (рис. 1.3.5, прямая 2). Аналогичные результаты плучены при рН=7.3. Рисунок 1.3.6 представляет зависимость константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной реакции при значении рН 6.4 от вязкости реакционной среды, из которого видно, что при одних и также значения вязкости реакционной среды и фиксированном значении рН, константы спада биолюминесценции имеют близкие значения и в глицерине, и в сахарозе, возможно, из-за влиянии природы растворителя на этот кинетический параметр.  1- сахароза; 2- глицерин Рисунок 1.3.6 - Зависимость константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной реакции при значении рН = 6.4 от вязкости реакционной среды. Полученные результаты показали, что увеличение вязкости реакционной среды при введении, как глицерина, так и сахарозы приводит к уменьшению константы спада биолюминесценции, а значит, к увеличению времени жизни долгоживущего интермедиата биолюминесцентной сопряженной системы, то есть к его стабилизации, причем при рН 6.4 в сахарозе стабилизация наблюдается в большой степени. То есть, скорость распада фермент-субстратных комплексов монотонно изменяется с ростом доли органического компонента в реакционной среде: увеличивается с увеличением концентрации глицерина и сахарозы. Зависимость константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при рН 6,9 от вязкости реакционной среды представлена на рис. 1.3.7. Эксперименты показали, что присутствие возрастающих концентраций органических растворителей - сахарозы и глицерина - в реакционной среде биферментной биолюминесцентной системы приводит к стабилизации возбужденного интермедиата реакции. То есть, скорость распада фермент-субстратных комплексов монотонно изменяется с ростом доли органического компонента в реакционной среде: увеличивается с увеличением концентрации глицерина и сахарозы.  1- сахароза; 2- глицерин Рисунок 1.3.7 - Зависимость константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН 6,9 от вязкости реакционной среды. Константа спада биферментной биолюминесцентной системы, которая характеризуется скоростью распада долго живущего интермедиата, уменьшается с увеличением вязкости, как при введении глицерина, так и сахарозы. Максимальное уменьшение kcn наблюдается при введении в реакционную смесь глицерина: константа спада биолюминесценции уменьшается практически на 80% в 6М глицерине, тогда как при введении сахарозы kcn уменьшается всего на 20% в 8M сахарозе. Существенное влияние на изменение константы спада оказывает, по-видимому, природа растворителя. Из рис. 1.3.7 видно, что введение в реакционную смесь увеличивающихся концентраций глицерина приводит к увеличению времени жизни долгоживущего интермедиата, тогда как использование в качестве растворителя для реакционной среды буферно-сахарозных смесей не приводит к существенному увеличению времени жизни долгоживущего интермедиата. Эксперименты показали, что при рН 6,9 присутствие возрастающих концентраций органических растворителей - сахарозы и глицерина - в реакционной среде биферментной биолюминесцентной системы приводит к стабилизации возбужденного интермедиата реакции. То есть, скорость распада фермент-субстратных комплексов монотонно изменяется с ростом доли органического компонента в реакционной среде: увеличивается с возрастанием концентрации глицерина и сахарозы. Аналогичные результаты получены и для рН 7.8. Полученные результаты показали, что увеличение вязкости реакционной среды при введении как глицерина, так и сахарозы приводит к уменьшению константы спада биолюминесценции при значении рН = 6,9 и рН = 7.8, а значит, к увеличению времени жизни долгоживущего интермедиата биолюминесцентной сопряженной системы, то есть к его стабилизации, причем в сахарозе стабилизация наблюдается в большой степени. Полученные результаты показали, что при рН 7.8 увеличение вязкости реакционной среды при введении глицерина приводит к уменьшению константы спада биолюминесценции, а значит, к увеличению времени жизни долгоживущего интермедиата биолюминесцентной сопряженной системы, то есть к его стабилизации, причем в глицерине стабилизация наблюдается в большой степени, тогда как в сахарозе стабилизации практически не наблюдается. Исследование влияния рН на квантовый выход биферментной биолюминесцентной системы в условиях различной вязкости показало, что квантовый выход с увеличением концентрации сахарозы уменьшается при всех значениях рН, за исключением рН 6.4, где наблюдается небольшое увеличение квантового выхода (рис. 1.3.8). Увеличение вязкости биферментной биолюминесцентной системы путем введения органического растворителя - сахарозы приводит к увеличению испускания числа квантов, примерно в 1,5 раза, за счет стабилизации долгоживущего интермедиата (рис. 1.3.8). При введении в реакционную биферментную биолюминесцентную систему глицерина квантовый выход биолюминесценции уменьшается на 20%. Таким образом, при рН 6,4 увеличение вязкости реакционной среды биферментной биолюминесцентной реакции путем введения сахарозы приводит к увеличению испускания числа квантов, тогда как введение глицерина существенно не изменяет квантовый выход биолюминесценции. Можно предположить, что значение рН 6,4 стабилизирует квантовый выход в глицерине и способствует его возрастанию в сахарозе.  1 - сахароза; 2- глицерин Рисунок 1.3.8 - Зависимость квантового выхода биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН 6,4 от вязкости реакционной среды. На рисунке 3.1.9 представлена зависимость квантового выхода биолюминесценции биферментной биолюминесцентной реакции при значении рН 6,9 от вязкости путем введения органических растворителей: глицерина и сахарозы. Увеличение вязкости биферментной биолюминесцентной системы путем введения глицерина приводит к увеличению испускания числа квантов, примерно в 2 раза, за счет стабилизации долгоживущего интермедиата (рис. 1.3.9). При введении в реакционную биферментную биолюминесцентную систему сахарозы квантовый выход биолюминесценции уменьшается на 20%. На рисунке 1.3.10 представлена зависимость квантового выхода биолюминесценции биферментной биолюминесцентной реакции при рН 7,3 от вязкости путем введения органических растворителей: глицерина и сахарозы. Увеличение вязкости биферментной биолюминесцентной системы путем введения глицерина приводит к увеличению испускания числа квантов, примерно в 2 раза, за счет стабилизации долгоживущего интермедиата (рис. 1.3.10). При введении в реакционную биферментную биолюминесцентную систему сахарозы квантовый выход биолюминесценции уменьшается на 40%.  1- глицерин; 2- сахароза Рисунок 1.3.9 - Зависимость квантового выхода биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН 6,9 от вязкости реакционной среды.  1- глицерин; 2- сахароза Рисунок 1.3.10 - Зависимость квантового выхода биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН 7,3 от вязкости реакционной среды. На рисунке 1.3.11 представлена зависимость квантового выхода биолюминесценции биферментной биолюминесцентной реакции при рН 7,9 от вязкости путем введения органических растворителей: глицерина и сахарозы. При введении в реакционную биферментную биолюминесцентную систему сахарозы квантовый выход биолюминесценции уменьшается на 60%.  1- глицерин; 2- сахароза Рисунок 1.3.11 - Зависимость квантового выхода биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН 7,9 от вязкости реакционной среды. Для подбора условий (рН, вязкость и другие физико-химические характеристики микроокружения ферментов биолюминесценой системы), при которых не происходит инактивации и термоинактивации биферментной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин и сохраняется высокая субстратная специфичность ферментов, что наилучшим образом отвечает условиям работы ферментов in vivo, были проведены эксперименты по изучению кинетических параметров бактериальной биолюминесцентной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин при разных температурах. Исследование влияния вязкости среды на интенсивность свечения биферментной системы показало, что введение увеличивающихся концентраций сахарозы и глицерина в реакционную среду в конечном итоге приводит к уменьшению интенсивности свечения. Квантовый выход биферментной биолюминесцентной реакции с увеличением концентрации сахарозы уменьшается при всех значениях рН. Изменение рН (как увеличение, так и уменьшение по отношению к контролю) приводит к уменьшению испускания квантов. Квантовый выход биферментной биолюминесцентной системы при введении глицерина не изменяется в кислой среде и увеличивается в щелочной, по сравнению с контрольным. Таким образом, увеличение вязкости реакционной среды биферментной биолюминесцентной реакции путем введения глицерина приводит к увеличению испускания числа квантов, тогда как введение сахарозы не изменяет существенно квантовый выход. Таким образом, в ходе экспериментального изучения кинетических параметров работы ферментов в вязких растворах сахарозы и глицерина и в буферном растворе с низкой вязкостью при изменении рН были получены следующие основные результаты: 1). Подобраны условия (рН, вязкость и другие физико-химические характеристики микроокружения ферментов биолюминесценой системы), при которых не происходит инактивации биферментной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин и сохраняется высокая субстратная специфичность ферментов, что наилучшим образом отвечает условиям работы ферментов in vivo. 2). Получены результаты, которые позволят варьировать условиями реакционной среды (рН, вязкости) для увеличения интенсивности свечения и квантового выхода биолюминесцентной реакции, приводящие в конечном итоге к увеличению чувствительности биолюминесцентного анализа. В частности, исследование влияния вязкости и рН реакционной среды на биферментную биолюминесцентную бактериальную систему НАДН:ФМН-оксидоредуктаза- люцифераза показало, что увеличение вязкости реакционной среды для биолюминесцентной биферментной бактериальной реакции приводит к уменьшению максимального значения интенсивности свечения и константы спада при различных значениях рН, а значения рН–оптимума изменяются только в присутствии в реакционной среде высоких концентраций глицерина и сахарозы. 3) Интенсивность свечения биолюминесценции линейно уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды, как в глицерине, так и в сахарозе, и практически не зависит от природы используемого растворителя при нейтральном значении рН. Увеличение вязкости реакционной среды биферментной биолюминесцентной реакции путем введения глицерина приводит к увеличению испускания числа квантов, тогда как введение сахарозы существенно не изменяет квантовый выход биолюминесценции. 4). Предложены объемные пропорции компонентов реакционной среды, влияющих на активный центр люциферазы и характер связи субстратов с ферментом. В частности, в экспериментальной модели ЭМглицерин стабилизация возбужденного интермедиата происходит в большей степени при увеличении вязкости реакционной среды, чем в модели ЭМсахароза. | ||||||||||||||
Похожие:
 | Тема: Ферменты как биологичексие катализаторы. Кинетика ферментативных реакций Цель: Установить основные принципы обнаружения ферментов в биологических объектах (на примере амилазы и уреазы). Ознакомиться с основными... |  | Реферат Разработка метода оценки физического состояния спортсменов... Разработка метода оценки физического состояния спортсменов с использованием биолюминесцентной системы светящихся бактерий |
| Метаболизм: фазы и стадии. Общий путь катаболизма Формирование представлений о метаболизме как совокупности взаимосвязанных ферментативных реакций в клетке, специфических и общей... | | Рабочая программа моделирование транспортных процессов направление... Моделирование транспортных процессов: рабочая программа / авт сост. В. Б. Вилков, спб.: Ивэсэп, 2013. – 21 с |
| Агентно-ориентированное моделирование поведения сложных систем в среде интернет Представлена реализация среды моделирования на основе системы моделирования дискретных событий, позволившая комплексировать агентно-ориентированное... | | Математическое моделирование экономических систем «Основы математического моделирования экономических систем» должно способствовать развитию у студентов более глубокого понимания... |
| Примерной программы дисциплины Компьютерное моделирование систем... Срс) различного назначения, в том чис ле систем мобильной свя зи (смс) и систем радиодоступа (срд), а так же обес пе чить раз ви тие... | | Рабочая программа по дисциплине опд. Ф. 08 Моделирование и оптимизация... Курс «Моделирование и оптимизация технологических процессов» является прикладной наукой, занимающейся вопросами моделирования рациональных... |
| Рабочая программа по дисциплине опд. Ф. 08 Моделирование и оптимизация Курс «Моделирование и оптимизация технологических процессов» является прикладной наукой, занимающейся вопросами моделирования рациональных... | | Отчет по проекту №38: Разработка рекомендаций по реализации Болонского... Программы: Научно-методическое обеспечение функционирования и модернизации системы образования |
| Квантово-химическое моделирование нелинейно-оптических характеристик... Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте органической и физической химии | | Тема Бактерии Бактерии. Многообразие бактерий. Строение и жизнедеятельность бактерий. Размно жение бактерий |
| Нормальная физиология Обучение системному подходу в процессе изучения физиологических механизмов и процессов, лежащих в основе функционирования органов... | | Программа научного семинара " Моделирование и оптимизация бизнес процессов " Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов направления 080500. 68 Бизнес-информатика... |
| Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину,... | | Рабочая программа учебной дисциплины проектирование информационных... Целью дисциплины является: изучение методологии структурного анализа, моделирование информационных систем в стандарте idef, проектирование... |
