Отчет по проекту №2 2/5309 «Моделирование процессов функционирования сопряженных ферментативных систем в клетке на примере ферментов светящихся бактерий» аналитической

Реферат

1. 
   Для решения фундаментальной задачи понимания механизмов сопряжения и функционирования ферментативных метаболических цепей в клетке созданы 4 прототипа экспериментальных моделей (ЭМсахароза, ЭМглицерин ЭМкрахмал ЭМжелатин), в которых реконструирована цепь сопряжения двух ферментов светящихся бактерий (люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы) в растворах повышенной вязкости (сахарозы и глицерина), а также в матричной структуре крахмального или желатинового геля. Модели проявляют биолюминесцентную активность и имитируют вязкое микроокружение ферментов в матриксе, а также связь с мембранными структурами.
   
2. 
   Установлены механизмы стабилизации биферментной системы светящихся бактерий путем создания благоприятного микроокружения близкого к in vivo посредством иммобилизации ферментов в гели крахмала и желатина с сохранением функциональной активность ферментов, что подтверждается спектрально-люминесцентными анализом. Показано, что наиболее эффективным механизмом стабилизации биферментной системы является совместная иммобилизация люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы, а также их субстратов и кофакторов в 3 % крахмальный гель. Биферментная система, иммобилизованная совместно с субстратами и кофакторами, сохраняет свою активность в течение длительного времени, не требует специальных условий хранения.
   
3. 
   Показано, что иммобилизация в крахмальный и желатиновый гели приводит к значительной стабилизации биферментной системы по отношению к денатурирующим воздействиям: рН-оптимум расширяется, как в кислую, так и щелочную области, сохраняется высокая активность ферментов при увеличении концентрации солей, повышается термостабильность.
   
4. 
   Установлено, что термоинактивация биферментной системы в желатиновом и крахмальном гелях имеет нелинейный характер и протекает по диссоциативному механизму.
   
5. 
   Описано влияние процесса иммобилизации и вязкости среды на субстратную специфичность ферментов. Показано, что при использовании желатинового геля выход активности существенно ниже, а значения K_{m каж} для ФМН и НАДН, а также величина энергии активации более высоки, чем в случае крахмального геля. Полученные закономерности объясняются различиями в физико-химических характеристиках и природе гелеобразующих полимеров.
   
6. 
   На примере биферментной системы светящихся бактерий показано, что изменение вязкости микроокружения оказывает влияние на механизмы сопряжения между ферментами в метаболических цепях, изменяет вероятность образования и скорость распада возбужденного интермедиата реакции.
   
7. 
   Подобраны условия (рН, вязкость и другие физико-химические характеристики микроокружения ферментов биолюминесценой системы), при которых не происходит инактивации и термоинактивации биферментной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин и сохраняется высокая субстратная специфичность ферментов, что наилучшим образом отвечает условиям работы ферментов in vivo.
   
8. 
   Установлена зависимость между термостабильностью биферментной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин и физико-химическими характеристиками микроокружения ферментов. Показано, что ЭМсахароза обладает большей термостабильностью по сравнению с моделью ЭМглицерин.
   
9. 
   Установлена гидрофобная природа взаимодействий при образовании фермент-субстратных комплексов. Эффекты влияния органических веществ и органических растворителей на ферменты объясняются как их прямым действием на гидратную оболочку или на активный центр белка, так и изменением электростатических и гидрофобных внутри- и межмолекулярных взаимодействий.
   
10. 
    Для соответствия характеристик вязких сред свойствам клеточной цитоплазмы необходимо создание комбинированной среды, содержащей высокую концентрацию макромолекул и низкую концентрацию сахаридов.
    
11. 
    Разработана методика оценки вязкости среды на основе анизотропии флуоресценции флавинмононуклеотида и установлено, что вязкость, характерная для клеточной цитоплазмы, достигается при концентрациях растворов крахмала и желатина более 2% (при 20С).
    
12. 
    Лучшим из 4 прототипов экспериментальных моделей является ЭМкрахмал. В крахмальном геле с добавлением ДТТ термоинактивация ферментов происходит с наименьшей скоростью. Энергия активации процесса термоинактивации биферментной системы в крахмальном геле с добавлением ДТТ в 3 раза выше по сравнению с энергией активации в буферном растворе.