Отчет по проекту №2 2/5309 «Моделирование процессов функционирования сопряженных ферментативных систем в клетке на примере ферментов светящихся бактерий» аналитической
Скачать 2.25 Mb.
|
Термоинактивация биферментной системы в растворе желатинаИзучение термоинактивации биферментной системы светящихся бактерий показало, что кинетика термоинактивации в присутствие в реакционной смеси 0,5% желатина и его отсутствие имеет принципиально одинаковый характер на всём диапазоне температур. При Т=30-40ºС наблюдается термоинактивация второго порядка, включающая в себя два различных механизма инактивации биферментной системы, последовательно сменяющие друг друга и протекающие с разными скоростями (Рис. 1.3.20). Известно, что бактериальная люцифераза и НАДН:ФМН-оксидоредуктаза обладают четвертичной структурой и представляют собой гетеродимер и гомодимер соответственно. Таким образом, логично предположить, что самым первым процессом, происходящим при термодеградации биферментной системы, является диссоциация ферментов на субъединицы. Как раз процессу диссоциации и соответствует первый «линейный» участок кинетических кривых термоинактивации. За расхождением субъединиц люциферазы и (или) НАДН:ФМН-оксидоредуктазы при высокой температуре, скорее всего, следует необратимая денатурация ферментов: люциферазы и (или) НАДН:ФМН-оксидоредуктазы. То есть второму «линейному» участку кинетических кривых термоинактивации биферментной системы, наверняка, соответствует денатурация ферментов. На данном этапе исследований, к сожалению, невозможно точно сказать, у какого именно фермента происходит нарушение структуры. Для этого необходимы дальнейшие подробные исследования термоинактивации люциферазы и оксидоредуктазы отдельно друг от друга. Следовательно, можно предположить, что термоинактивация биферментной системы светящихся бактерий происходит по диссоциативному механизму.  a – без желатина; b – 0,5% раствор желатина. Рисунок 1.3.20 - Кинетические кривые термоинактивации биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза при разных значениях температуры в присутствие 0,5% желатина и его отсутствии. При Т=15-25ºС в присутствие 0,5% желатина и его отсутствие наблюдается медленная инактивация биферментной системы по первому порядку. Предположительно она связана с процессом диссоциации ферментов на субъединицы. Денатурация при такой невысокой температуре не происходит. Из рисунка 1.3.20 видно, что первый этап термоинактивации, соответствующий диссоциации ферментов, в желатине происходит с большей скоростью, чем без него, при всех исследованных температурах. При этом наличие желатина практически не влияет на скорость денатурации. Изучение термоинактивации биферментной системы в 1% растворе желатина показало, что кинетика термоинактивации в присутствие в реакционной смеси желатина и его отсутствие имеет одинаковый характер не на всём диапазоне температур, как в случае 0,5% желатина, а лишь при Т>Тг. При Т=23-38ºС кинетические кривые инактивации в полулогарифмических координатах состоят из двух «линейных» участков, соответствующих процессам диссоциации и денатурации (Рис. 1.3.21). При Т>43ºС наблюдается быстрая инактивация первого порядка. Это объясняется тем, что кинетические режимы термоинактивации становятся экспериментально неразличимыми из-за резкого увеличения с ростом температуры скорости диссоциации ферментов на субъединицы. Значительного различия скоростей инактивации в присутствие желатина и его отсутствие не наблюдается. Причиной этому может служить тот факт, что процесс диссоциации происходит слишком быстро при высоких температурах, а скорости денатурации ферментов в желатине и без него, как и в предыдущем случае, практически одинаковы.  a – без желатина; b – 1% раствор желатина. Рисунок 1.3.21 - Кинетические кривые термоинактивации биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза при разных значениях температуры в присутствие 1% желатина и его отсутствие. При анализе кривых инактивации, полученных для 5% желатина, было выявлено, что кинетика термоинактивации в присутствие в реакционной смеси желатина и его отсутствие, также как и для 1% желатина, имеет похожий вид только при Т>Тг. При Т=28-38ºС наблюдается термоинактивация второго порядка, а при Т>43ºС – первого порядка (Рис. 1.3.22). Однако, в данном случае скорость денатурации ферментов в желатине несколько ниже, чем в его отсутствие.  a – без желатина; b – 5% раствор желатина. Рисунок 1.3.22 - Кинетические кривые термоинактивации биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза при разных значениях температуры в присутствие 5% желатина и его отсутствие. При температурах, меньших температуры гелеобразования желатина (Т<Тг), в желатинах с концентрациями 1% и 5% происходит значительная активация биферментной системы с течением времени, в то время как в отсутствие желатина идёт медленная инактивация по первому порядку. Пример таких кинетических кривых для 1% желатина приведён на рисунке 1.3.23. Этот необычный результат лишний раз подтверждает факт стабилизации ферментов при их помещении в гелевую матрицу желатина. Кроме того, было замечено, что при помещении биферментной системы, выдержанной в присутствие желатина при высокой температуре (35-50ºС) в течение небольшого промежутка времени (30 с – 1 мин), обратно в условия с комнатной температурой (≈20ºС) происходит ее реактивация (Рис. 1.3.24). В отсутствие желатина такой эффект тоже наблюдается, однако в желатине реактивация гораздо более сильно выражена. Таким образом, можно сделать вывод о том, что процесс термоинактивации биферментной системы частично обратим, а также о том, что наличие желатина способствует восстановлению активности ферментов.  Рисунок 1.3.23 - Зависимость интенсивности свечения биферментной системы от времени выдерживания в присутствие 1% желатина и его отсутствие при Т=10ºС в полулогарифмических координатах.  Рисунок 1.3.24 – Кинетические зависимости интенсивности свечения биферментной системы для разных интервалов времени выдерживания в 1% растворе желатина при 48ºС. Сравнение кинетических кривых термоинактивации в присутствие желатинов разной прочности (Bloom) показало, что принципиальных различий кинетических характеристик биферментной системы в разных желатинах нет. Также было выяснено, что, несмотря на снижение абсолютного значения активности биферментной системы в растворах желатина, отношение активности в присутствие желатина к активности в отсутствие желатина растет с увеличением времени инкубирования ферментов при данной температуре. Таким образом, показано, что активность биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза и кинетика её термоинактивации в желатине низкой концентрации (предположительно, не достаточной для образования геля) и в желатине высокой концентрации (достаточной для образования геля) различаются. Термоинактивация биферментной системы имеет нелинейный характер и, предположительно, протекает по диссоциативному механизму. Желатин, находящийся в жидкой фазе, ускоряет первый этап термоинактивации, а гелеобразный желатин, напротив, способствует активации биферментной системы. В присутствие желатина возможна реактивация биферментной системы при комнатной температуре. 1.3.4 Изучение связи «структура-функция» в зависимости от микроокружения Была проверена применимость термодинамической модели денатурирующего действия органических растворителей на различные белки и ферменты к люциферазам. Авторами модели (Белова и др., 1991) предложен новый параметр ДС – денатурирующая сила, который учитывает несколько характеристик органических растворителей: параметр гидрофобности (-logP), размер молекулы, сольватирующую способность, и предполагает, что денатурация растворителями происходит, в основном, из-за вытеснения молекул воды из гидратной оболочки белка. Данная термодинамическая модель широко используется для описания функционирования различных ферментов в водно-органических средах. Следуя методике авторов, для расчета и "привязки" шкалы ДС к люциферазе, были выбраны "хорошие" опорные органические растворители: этиленгликоль и ацетон, имеющие значительные различия в величинах ДС (табл.1.3.7), и средние для различных ферментов значения параметров logX этих растворителей. На основе экспериментальных пороговых концентраций С50 ЭТГЛ и АЦ для обеих люцифераз построены теоретические прямые корреляции С50 от параметра logX (рис. 1.3.25, прямые 1,2). Значения logX (табл. 1.3.7) для других растворителей рассчитаны по формуле: logX=((ДСх-ДСэтгл)/(ДСац-ДСэтгл))·(logАЦ-logЭТГЛ)+logЭТГЛ. Теоретические значения пороговых концентраций растворителей С50(т) определены графически из теоретических корреляционных прямых (табл. 1.3.7). Экспериментальные пороговые концентрации органических растворителей С50(э) значительно отличаются от теоретических (табл. 1.3.7) и коррелируют с параметром logX с низкими коэффициентами корреляции, около 46% для обеих люцифераз (рис. 1.3.25, кривые 1`, 2`). Отсюда следует, что вытеснение воды из гидратной оболочки люцифераз ,по-видимому вносит определенный вклад в ингибирование биолюминесценции. Для параметра ДС, так же как и (-logP), наблюдается общая тенденция: с увеличением ДС уменьшается пороговая концентрация С50. Использование шкалы ДС, приведенной в работе, может только качественно охарактеризовать действие органических растворителей на люциферазу: сильный денатурант, слабый денатурант. Значения С50 для любых органических растворителей, предсказанные теоретически, плохо соотносятся с практическими полученными пороговыми концентрациями.  1,2 – теоретические; 1`,2` - экспериментальные корреляционные прямые для люцифераз Р.leiognathi и V.harveyi, соответственно, при использовании тетрадеканаля Рисунок 1.3.25 - Корреляция пороговых концентраций органических растворителей С50 с параметром (-logX). По-видимому, действие органических растворителей на белок не ограничивается вытеснением воды из гидратной оболочки фермента, а сопровождается влиянием органических растворителей на связывание люциферазы с ее субстратами (ФМН и альдегидом), кроме того, не учтено и взаимодействие между субстратами и средой. Таблица 1.3.7. Шкала ДС, рассчитанные значения параметра (-logХ) и экспериментальные (С50(э), об.%) и теоретически рассчитанные (С50(т), об.%) пороговые концентрации органических растворителей для люцифераз Р.leiognathi и V.harveyi при использовании тетрадеканаля.
Как известно, характер нативной конформации белка определяется не каким-либо одним эффектом, а представляет собой результат совместного тонко сбалансированного действия целого ряда факторов и взаимодействий. Реально существующая структура белков упорядочена и компактна и определяется, в основном, гидрофобными взаимодействиями, которые чаще всего рассматриваются как стабилизирующий фактор для белковых макромолекул. Проверка применимости термодинамической модели Беловой, Можаева с сооавторами, основанной на представлении о том, что денатурация белков органическими растворителями происходит в основном из-за вытеснения молекул воды из гидратной оболочки фермента показала, что, во-первых, процесс инактивации ферментативной активности люцифераз складывается из процессов увеличения гидрофобности реакционной среды при введении органических растворителей и вытеснения молекул воды из гидратной оболочки белка; во-вторых, теоретически определенные значения пороговых концентраций органических растворителей на основании шкалы ДС превышают экспериментально полученные значения С50 для обеих люцифераз; в третьих, шкала ДС качественно характеризует действие органических растворителей на люциферазы: сильный денатурант, слабый денатурант. Таким образом, термодинамическая модель качественно описывает процесс потери ферментативной активности. 1.3.5 Обеспечение условий вязкости, подобных условиям в клеточном матриксе Был проведен поиск наиболее чувствительных компонентов систем, позволяющих оптимизировать состав компонентов в предложенных прототипах моделей для выбора условий, в которых влияние вязкости на активность биолюминесцентных систем соответствовало бы условиям работы ферментов в клеточном матриксе. Проанализировано соответствие вязкости исследованных экспериментальных моделей вязкости клеточной цитоплазмы. С одной стороны, известно, что абсолютная вязкость цитоплазмы колеблется от 2 до 50 спз и меняется в различных частях клетки и в разные периоды клеточного цикла. Особенностью цитоплазмы является то, что при понижении температуры ниже 12—15°С и повышении выше 40—50°С вязкость цитоплазмы увеличивается. Для двух из использованных экспериментальных моделей – ЭМглицерин и ЭМсахароза зависимость вязкости среды от концентрации хорошо изучена (Никольский и др., 1963). Из литературных данных следует, что для достижения вязкости, присущей клеточной цитоплазме, необходимо очень высокое содержание глицерина и сахарозы в растворе (20-75% (2,2-8,2М) и 25-60% (1,4-3,4М) соответственно). Такие концентрации действуют ингибирующе на биолюминесцентную реакцию (см. п.1.1.1 отчета). Таким образом, ЭМглицерин и ЭМсахароза не могут в полной мере соответствовать природным условиям функционирования биолюминесцентной системы в бактериальной клетке. С другой стороны, известно, что вязкость биологических сред определяется в большинстве случаев структурной вязкостью. В частности, вязкость клеточной цитоплазмы связана со структурой составляющих её биополимеров и субклеточных образований, что вызывает отклонения вязкого течения от ньютоновского закона нормальных жидкостей. Биохимические процессы в клетках происходят при высокой концентрации макромолекул – 50-400 мг/мл (Таблица 1.3.8). И хотя общая концентрация каждого конкретного вида макромолекул невелика, эти соединения стремятся локализоваться в определенной области клетки (молекулярный краудинг). Такие условия также оказывают влияние на характер протекания биохимических процессов. Таблица 1.3.8 Примерный химический состав бактериальной клетки
Все это говорит о необходимости создания экспериментальной модели с использованием высоких концентраций макромолекул. Действие таких модельных сред на биолюминесценцию (ЭМжелатин и ЭМкрахмал) было изучено (см. п.1.3.2 отчета). Разработана методика оценки вязкости среды с помощью молекулы ФМН в качестве флуоресцентного зонда. Для этого проведено измерение времен жизни флуоресценции ФМН в растворах, содержащих различные концентрации глицерина, сахарозы, желатина и картофельного крахмала (таблица 1.3.9). Установлено, что с ростом содержания глицерина и сахарозы в среде увеличивается время жизни флуоресценции молекулы ФМН, а в присутствии крахмала и желатина (за исключением последнего в концентрации 5%) оно не изменяется. Следует отметить, что изменение времени жизни флуоресценции является недостатком флуорофора, претендующего на роль зонда для измерения вязкости (идеальный зонд должен иметь неизменное время жизни флуоресцентного состояния). Тем не менее, возможно учесть погрешность, вводимую изменением данного параметра. Таблица 1.3.9 Измеренные времена жизни и анизотропия флуоресценции ФМН в разных средах и вычисленные времена вращательной корреляции (20С, возбуждение 450 нм)
* Табличные значения (Никольский и др., 1963) # Значения вычислены с помощью калибровочной зависимости Используя полученные времена жизни и значения анизотропии флуоресценции, были вычислены времена вращательной корреляции ФМН (cal) для исследованных сред по формуле (Lacowicz, 2006):  ,где - время жизни флуоресценции, r0 – фундаментальная анизотропия ФМН (равная 0,354), r – экспериментально измеренная анизотропия флуоресценции ФМН (таблица 1.3.5.2). Известно, что время вращательной корреляции линейно связано с вязкостью среды () по формуле (Lacowicz, 2006):  ,где V- объем вращающейся частицы, k – константа Больцмана, Т – температура. На основе вычисленных времен вращательной корреляции и известных значений вязкости растворов, содержащих глицерин, была построена калибровочная зависимость для определения вязкости других сред (рисунок 1.3.26). На предыдущем этапе было выявлено, что использованные среды не оказывают влияния на структуру электронно-возбужденных состояний молекулы ФМН, а значит, можно допустить, что объем молекулы ФМН не изменяется при переходе из одной среды в другую.  Рисунок 1.3.26 – Калибровочная прямая для определения вязкости микроокружения ФМН Получено эмпирическое уравнение, связывающее время вращательной корреляции ФМН и вязкость среды:  .Используя данное уравнение, были оценены вязкости растворов, содержащих желатин и крахмал. Получено, что в диапазон значений вязкости клеточной цитоплазмы (2-50 спз) попадают вязкость 5%-х растворов данных веществ (таблица 1.3.9) при 20С. Интерполяция полученных значений позволяет оценить, что, начиная приблизительно с 2%-го содержания биополимера, вязкость микроокружения ФМН превышает 2 спз, т.е. становится схожей с характеристиками клеточной цитоплазмы. Следует отметить, что методика эксперимента (а именно, частое перемешивание и термостатирование в течение не более 20 минут) предполагает, что в исследованных образцах не происходило образования геля. Таким образом, разработана методика оценки вязкости среды на основе анизотропии флуоресценции флавинмононуклеотида и установлено, что вязкость, характерная для клеточной цитоплазмы, достигается при концентрациях растворов крахмала и желатина более 2% (при 20С). 1.4. Обоснованность и достоверность полученных результатов Полученные в проекте научные результаты подтверждают гипотезу о возможности стабилизации ферментов путем иммобилизации. Результаты, полученные для ферментов светящихся бактерий, могут быть применимы для создания экспериментальных моделей функционирования других фермент-субстратных комплексов в клетке. Подготовлены экспериментальные образцы многокомпонентного иммобилизованного реагента, готовые для использования в биотестировании сточных вод промышленных предприятий. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | Тема: Ферменты как биологичексие катализаторы. Кинетика ферментативных реакций Цель: Установить основные принципы обнаружения ферментов в биологических объектах (на примере амилазы и уреазы). Ознакомиться с основными... |  | Реферат Разработка метода оценки физического состояния спортсменов... Разработка метода оценки физического состояния спортсменов с использованием биолюминесцентной системы светящихся бактерий |
| Метаболизм: фазы и стадии. Общий путь катаболизма Формирование представлений о метаболизме как совокупности взаимосвязанных ферментативных реакций в клетке, специфических и общей... | | Рабочая программа моделирование транспортных процессов направление... Моделирование транспортных процессов: рабочая программа / авт сост. В. Б. Вилков, спб.: Ивэсэп, 2013. – 21 с |
| Агентно-ориентированное моделирование поведения сложных систем в среде интернет Представлена реализация среды моделирования на основе системы моделирования дискретных событий, позволившая комплексировать агентно-ориентированное... | | Математическое моделирование экономических систем «Основы математического моделирования экономических систем» должно способствовать развитию у студентов более глубокого понимания... |
| Примерной программы дисциплины Компьютерное моделирование систем... Срс) различного назначения, в том чис ле систем мобильной свя зи (смс) и систем радиодоступа (срд), а так же обес пе чить раз ви тие... | | Рабочая программа по дисциплине опд. Ф. 08 Моделирование и оптимизация... Курс «Моделирование и оптимизация технологических процессов» является прикладной наукой, занимающейся вопросами моделирования рациональных... |
| Рабочая программа по дисциплине опд. Ф. 08 Моделирование и оптимизация Курс «Моделирование и оптимизация технологических процессов» является прикладной наукой, занимающейся вопросами моделирования рациональных... | | Отчет по проекту №38: Разработка рекомендаций по реализации Болонского... Программы: Научно-методическое обеспечение функционирования и модернизации системы образования |
| Квантово-химическое моделирование нелинейно-оптических характеристик... Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте органической и физической химии | | Тема Бактерии Бактерии. Многообразие бактерий. Строение и жизнедеятельность бактерий. Размно жение бактерий |
| Нормальная физиология Обучение системному подходу в процессе изучения физиологических механизмов и процессов, лежащих в основе функционирования органов... | | Программа научного семинара " Моделирование и оптимизация бизнес процессов " Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов направления 080500. 68 Бизнес-информатика... |
| Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину,... | | Рабочая программа учебной дисциплины проектирование информационных... Целью дисциплины является: изучение методологии структурного анализа, моделирование информационных систем в стандарте idef, проектирование... |
