1.1.3 Подбор условий иммобилизации биферментной системы НАДН:ФМН-
оксидоредуктаза-люцифераза в гели различной природы
Была изучена эффективность работы люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы в гелевом окружении, имеющем различную химическую природу. Оптимизация микроокружения достигается за счет подбора соответствующей гелеобразующей системы в качестве носителей для иммобилизации. Предварительные исследования показали перспективность использования гелей для создания оптимального микроокружения ферментов и сохранения высокой каталитической активности. Метод иммобилизации в гели состоит в том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку из тесно переплетенных полимерных цепей, образующих гель. Среднее расстояние между соседними цепями в геле меньше размера молекулы включенного фермента, поэтому он не может покинуть полимерную матрицу и выйти в окружающий раствор. В качестве носителей для иммобилизации выбраны желатиновый и крахмальный гели, при которых не происходит инактивации и сохраняется высокая субстратная специфичность ферментов, что наилучшим образом отвечает условиям работы ферментов in vivo.
Рассматривались два варианта стабилизации ферментов на основе иммобилизации: в первом случае были иммобилизованы только НАДН:ФМН-оксидоредуктаза и люцифераза, во втором, проводили совместную иммобилизацию ферментов вместе с субстратами и кофакторами – алифатическим альдегидом (C14), ФМН и НАДН.
Показано, что выход активности при иммобилизации ферментов в гели зависит от природы используемого полимерного геля (рис. 1.1.11). В ходе эксперимента были исследованы характеристики биферментной системы, иммобилизованной в гели, приготовленные из картофельного, рисового и кукурузного крахмалов различных концентраций. Из рисунка 1.1.11 видно, что интенсивность свечения биферментной системы, иммобилизованной в «картофельный» гель, уменьшается с увеличением процентного содержания крахмала в геле. Для «рисового» геля разницы по интенсивности свечения между 4% и 5% гелем не наблюдали. В случае «кукурузного» геля достоверных различий по интенсивности свечения препаратов ферментов иммобилизованных в гели разной концентрации не получили.
Рисунок 1.1.11 - Зависимость интенсивности свечения иммобилизованной биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза от концентрации крахмала.
Максимальная активность наблюдалась у биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза–люцифераза, иммобилизованной в «картофельный» гель. Наиболее удобным в работе оказался 3,5% «картофельный» крахмальный гель. В этом случае иммобилизованные ферменты обладали высокой активностью (Imax=850mV), и сохранялась целостность иммобилизованных дисков. При использовании более низкой концентрации геля (3%) наблюдалось нарушение целостности дисков с иммобилизованными ферментами. Кроме того, гель низкой концентрации недостаточно связывал ферменты, и они быстро переходили из гелевой фазы в реакционную среду, при этом диск с иммобилизованными ферментами разрушался. При использовании высоких концентраций геля (4%, 5%) возникали сложности в дозировании препарата из-за высокой вязкости геля. Это связано с тем, что процедура иммобилизации проходит при температуре 300С, когда клейстеризация геля в основном завершается. Таким образом, в процессе проведения иммобилизации гель высокой концентрации быстро застывает, и включение фермента в матрицу геля становится практически невозможным.
Поэтому для проведения дальнейших исследований был выбран 3,5% «крахмальный» гель. При использовании данной концентрации картофельного крахмала в гелевом растворе, достигается высокий выход активности иммобилизованных препаратов и диски обладают достаточной прочностью.
Оптимальным временем высушивания иммобилизованных препаратов является 6-8 часов. При меньшем времени высушивания диски недостаточно высыхают и при помещении их в реакционную смесь быстро разрушаются. В работе был подобран температурный режим высушивания иммобилизованных препаратов. Высушивание дисков при 200С приводило к нарушению их целостности. Оптимальным режимом высушивания дисков является 40С - в этом случае диски обладают высокой активностью и целостностью, что упрощает использование их в биолюминесцентном анализе.
Далее исследовали способ стабилизации биферментной системы путем совместной иммобилизации ферментов и их субстратов. На рисунке 1.1.12 представлены зависимости интенсивности свечения биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза при добавлении одного из субстратов биферментной реакции в иммобилизованном виде, в то время как остальные компоненты добавляли в реакционную смесь в виде растворов. Максимальная активность биферментной системы наблюдалась при добавлении в реакционную смесь 13мкг ФМН; 137нг тетрадеканаля; 140 мкг НАДН для получения иммобилизованного реагента. При использовании меньших количеств субстратов активность иммобилизованных препаратов мала из-за недостатка субстратов, а при использовании больших количеств активность препаратов уменьшалась из-за ингибирования активности ферментов избытком субстратов.
На рисунке 1.1.13. представлены результаты исследования эффективности работы биферментной системы при совместной иммобилизации ферментов и их субстратов. Наибольшей активностью обладали реагенты, содержащие (R+L)+C14 и (R+L)+НАДН+С14, иммобилизованные в 3% и 3,5% крахмальный гель, в этих случаях выход активности ферментов составил 100% (Рис. 1.1.13). Многокомпонентные реагенты включающие: (R+L)+ФМН; (R+L)+НАДН; (R+L)+ФМН+C14 и (R+L)+ФМН+НАДН обладали низким выходом активности (от 1% до 5%). Максимальная активность иммобилизованного реагента, включающего все компоненты биферментной системы, составила 10%. Таким образом, наиболее стабильной является биферментная система, иммобилизованная совместно с альдегидом и НАДН.
 
Рисунок 1.1.12 - Зависимость интенсивности свечения биферментной системы от количества субстратов в иммобилизованных дисках («крахмальный» гель).
Рисунок 1.1.13 - Выход активности биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, иммобилизованной совместно с субстратами в крахмальный гель.
Были выбраны условия, обеспечивающие максимальную эффективность работы ферментов биферментной системы при использовании желатина в качестве носителя для иммобилизации. Максимальный выход активности биферментной системы, иммобилизованной в желатиновый гель, составил менее 20% как для реагента (R+L), так и для (R+L)+НАДН+С14 (рис. 1.1.14.) и достигнут при использовании 5% концентрации желатина.
Рисунок 1.1.14 - Выход активности иммобилизованной биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза.
Иммобилизованная биферментная система НАДН:ФМН-оксидоредуктаза- люцифераза не требует специальных условий хранения для обеспечения поддержания высокой активности ферментов: при иммобилизации в крахмальный гель максимальная активность сохраняется не менее одного года, при иммобилизации в желатиновый гель – один месяц. В то же время, интенсивность свечения раствора биферментной системы уменьшается до нуля в течение трех суток.
|
