Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций
Скачать 0.75 Mb.
|
Результаты исследований И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Получение препаратов антигенов вируса Марбург и изучение их иммуногенных и протективных свойств. На первом этапе исследования была проведена идентифицикация используемого для получения антигенов штамма Рорр вируса Марбург: показана идентичность мол. весов белков исследуемого вируса белкам вируса Марбург. Показано также, что белок с мол. весом 96 кД реагировал с сывороткой реконвалесцента, переболевшего геморрагической лихорадкой Марбург (рис. 1).  Рис. 1. Электрофоретическое изучение белков вируса Марбург и вестерн-блот-анализ. Дорожка 1– маркер мол. весов, дорожка 2– белки вируса Марбург, дорожка 3– нормальная сыворотка козы, дорожка 4– иммунная сыворотка козы, дорожки 5 и 6 – фракции Ig G козы, дорожка 7– нормальная сыворотка кролика, дорожка 8– иммунная сыворотка кролика, дорожка 9– сыворотка реконвалесцента № 700808. После этого выбирали культуры клеток для получения препаративных количеств вируса Марбург и определяли сроки сбора КВЖ (таблицы 1 и 2). Таблица 1 Определение чувствительности культур клеток к вирусу Марбург
* титр вируса определен при внутрибрюшинном заражении морских свинок. Таблица 2 Динамика накопления вируса Марбург в КВЖ при культивировании на монослойных культурах клеток ДК-58 и Л-68
* титр вируса определен при внутрибрюшинном заражении морских свинок. Показано, что штамм Рорр вируса Марбург эффективно нарабатывается на использованных культурах клеток. Для дальнейшей работы была выбрана культура Л-68, которая решением ГИСК им. Л.А. Тарасевича от 09.06.87г. была рекомендована как возможный субстрат для производства медицинских иммунобиологических препаратов. Максимальных значений титр вируса достигал на 3-и сут после заражения и составлял 7,58 + 0,33 lg ЛД50/мл. Проверка показала, что после смены питательной среды на 3 сут концентрация вируса в КВЖ на 5-й день вновь достигала высоких значений (7,2 lg ЛД50/мл). После второй смены среды на 5-е сут и сбора КВЖ на 7-е сут вирус накапливается в КВЖ в меньших количествах (6,0 lg ЛД50/мл). Исходя из результатов исследования, дальнейшее накопление вируса проводили на монослое клеток Л-68 с множественностью заражения 0,1 ЛД50/кл., на однолитровых культуральных сосудах, используя двойной слив КВЖ. Для получения препаратов белков NP и VP40 вируса Марбург использовали хроматографическое (ВГЖХ) фракционирование на колонке с носителем полисил-500-ОДС (рис. 2). Препараты рекомбинантных белков GP и VP24 были любезно предоставлены д-ром S. Becker (Институт вирусологии, Марбург, Германия). В качестве препарата сравнения использован концентрированный очищенный инактивированный вирус Марбург, полученный по технологии, описанной в патенте RU 2029561 С1. Изучение гуморального ответа на введение препаратов показало, что рекомбинантный белок GP, полученный в бакуловирусной системе, вызывал индукцию специфических антител в наибольших титрах как при иммунизации мышей, так и при иммунизации морских свинок (рис. 3). Специфический клеточный ответ, изучаемый методом РБТЛ, регистрировался у животных только при введении белков NP и GP вируса Марбург. Иммунизация белком NP обеспечивала максимальную защиту морских свинок от введения летальных доз вируса Марбург – коэффициент защиты при введении дозы вируса Марбург 50 ЛД50 равнялся 70+14 %. Для препарата белка VP40 уровень защиты составлял 16+8 %, для препарата белка VP24 – 14+4 %, а для препарата белка GP –26+6 %.  Рис. 2. Профиль элюции белков вируса Марбург (А) и электрофореграммы фракций, выделенных в 12% ПААГ белков NP и VP40 вируса Марбург (Б). Дорожка 1 - фракция, содержащая белок NP, дорожка 2 - фракция, содержащая белки NP и VP40, дорожка 3 - фракция, содержащая VP40, дорожка 4 – электрофорез очищенного вируса Марбург.   Рис. 3. Формирования гуморального ответа у морских свинок после однократного (А) и двукратного на 0 и 14 сут (Б) введения препаратов белков вируса Марбург. Таблица 3 Изучение протективной активности белков вируса Марбург при введении белка в дозе 20 мкг/ животное и дозе активного вируса Марбург для заражения 50 ЛД50/животное
* - введение с интервалом 16 сут, ** - не исследовали, GP (б) - препарат рекомбинантного белка GP, полученный в бакуловирусной системе, GP (ВОВ) - рекомбинантный белок GP в составе осповакцины. Таким образом, были получены и изучены иммунологические свойства препаратов четырех структурных белков вируса Марбург. На основе полученных экспериментальных данных может быть оценен возможный вклад каждого из изученных белков в формирование иммунного ответа против геморрагической лихорадки Марбург. Разработка средств профилактики кори. Вакцина против кори в связи с принятием программы по элиминации этого заболевания, остро востребована. В настоящее время все производители выпускают живую вакцину для парентерального использования. Стратегия вакцинации, позволяющая индуцировать формирование барьерного иммунитета на слизистых оболочках, могла бы быть более эффективной при защите от кори. Работа по изучению возможности получения эффективной пероральной формы вакцины проведена на двух видах животных кроликах и обезьянах. У животных после иммунизации оценивали показатели гуморального и клеточного иммунитета. Иммунизированные обезьяны кроме этого были заражены диким штаммом вируса кори. На модели кроликов показали принципиальную возможность создания вакцины против кори для перорального применения, а на модели обезьян подтвердили, что вирус при внесении в просвет кишечника, может вызвать формирование гуморального и клеточного иммунного ответов (табл. 4). Таблица 4 Изучение иммуногенных и протективных свойств живой коревой вакцины при пероральном применении в дозе 103,5 ТЦД50/животное
* - показатель не изучался. При заражении иммунизированных обезьян диким штаммом BIL вируса кори обнаружено, что вирус в лаваже и мононуклеарных клетках крови определялся только у контрольной обезьяны и у трех обезьян, у которых согласно приведенным в таблице 3 данным не был сформирован иммунный ответ. Обе обезьяны, вакцинированные внутримышечно, и одна из обезьян, которым вирус был введен в просвет тонкого отдела кишечника, оказались защищены от заражения. В другой серии экспериментов был сконструирован и проверен вариант кандидатной ДНК-вакцины против кори, представляющий собой рекомбинантную плазмиду, содержащую встройку гена гемагглютинина вируса кори и включенного в ВПЧ (рис. 4). Такого рода вакцина может быть востребована для иммунодефицитных пациентов, которым нельзя вводить аттенуированный вирус или для вакцинопрофилактики заболевания на поздних этапах выполнения программы элиминации кори.  Рис. 4. Изучение гуморального (А) и клеточного (Б) ответа у мышей, 3-кратно иммунизированных вариантом кандидатной ДНК-вакциной против кори (стрелками обозначены сроки иммунизации). Как следует из рисунка 4А, трехкратное введение препарата приводило к появлению общих и нейтрализующих антител в сыворотке крови мышей. Формирование гуморального иммунитета в ответ на введение кандидатной ДНК-вакцины подтверждено Вестерн-блот анализом. У иммунизированных препаратом ДНК-вакцины животных формировался также специфический клеточный ответ (рис. 4Б), изученный с использование РБТЛ и метода ELISPot. Таким образом, обоснована перспективность двух направлений в разработке новых вакцин против кори: первое – возможность создания более безопасного с точки зрения применения и экономически выгодного, с точки зрения обеспечения процесса вакцинации, препарата. Второе – возможность создания профилактического противокоревого препарата на основе реплицирующегося вектора, включенного в ВПЧ, альтернативного живой аттенуированной вакцине. Получение антигена вируса кори и разработка средств диагностики на его основе. Тест-система для выявления антител класса М к вирусу кори необходима при ранней диагностики заболевания, а для антител класса G – для подтверждения диагноза, и для проведения серомониторинга. Для разработки иммуноферментной тест-системы использовали референс-штамм Эдмонстон и штамм NovО96, выделенный во время вспышки кори в детском доме в Новосибирске. Проведение электронно-микроскопических исследований зараженных клеток Vero выявило репродукцию парамиксовируса. Инфицированные клетки содержали типичные для парамиксовирусов скопления трубчатых нуклеокапсидов, а на поверхности цитоплазматических мембран наблюдалось формирование вирусных частиц. В целом ультраструктурное строение вируса кори соответствовало описанному в литературе для парамиксовирусов (Scheid А., 1987). Вирус кори был очищен центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (10-60 %). После ультрацентрифугирования собранные фракции были изучены в реакции гемагглютинации с эритроцитами обезьяны Macaca mulatta; показано наличие гемагглютинирующей активности в двух фракциях (рис. 5, А). При электронно-микроскопическом исследовании в очищенных препаратах обнаружены вирусные частицы и нуклеокапсиды с характерной для вируса кори структурой. Вирусные частицы различались по форме и размерам. Электрофоретический анализ препаратов в ПААГ (рис. 5, Б) выявил высокую степень очистки вируса – 70-75 %. Видовая принадлежность штамма подтверждена в иммуноблоте (рис. 5, В): антитела из сыворотки реконвалесцента (пациента с клиническим диагнозом «корь», подтвержденным лабораторными методами) связывались с белками NP и F вируса кори.
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | Тема: патогенные кокки Овладеть основными методами лабораторной диагностики, терапии и профилактики кокковых инфекций |  | Паразитарные инфекции у детей Овладение знаниями, умениями и навыками в области природно-очаговых и паразитарных инфекций у детей, включающими этиологию, эпидемиологию,... |
| Международный Фестиваль Культуры и Искусства Естественные науки Опытно-экспериментальная... Я решил писать данную работу, чтобы узнать побольше об истории появления тригонометрии, способах решения тригонометрических уравнений... | | Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств... ... |
| Носитель антигенов Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии. Предлагается носитель антигенов в виде липидного комплекса, состоящего из гликозида,... | | Некоторые аспекты диагностики tоrch-инфекций в акушерстве Коханского ул., д. 7, г. Чита, 672038, тел. 31-43-23, факс. (302-2) 31-43-24 |
| Использование презентации на уроке немецкого языка Данное методическое пособие предназначено для специалистов системы профилактики правонарушений несовершеннолетних, их реабилитации... | | Клинико-эпидемиологическая характеристика парентеральных вирусных... Работа выполнена в гу нии эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи рамн г. Москва и на кафедре акушерства и гинекологии гоу... |
| Выпускная работа по «Основам информационных технологий» Интерфероны являются многофункциональными компонентами защиты против вирусных и паразитарных инфекций и некоторых опухолей. Они влияют... | | Московский энергетический институт (технический университет) Целью дисциплины является получение знаний о современных методах радиоизмерений, о возможностях современной контрольно-измерительной... |
| Ротавирусная инфекция у детей: серьезное заболевание Ротавирус – очень заразная группа вирусных инфекций, чаще всего поражающих детей в возрасте от шести месяцев до двух лет. Основные... | | эпидемиологическая характеристика внутрибольничных гепатитов в и... Институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л. В. Громашевского амн украины, заведующий лабораторией вирусных гепатитов и... |
| Городского округа красноуфимск постановление О внесении изменений в постановление главы городского округа Красноуфимск №43 от 24. 01. 2011 года «Об утверждении комплексного плана... | | Эпидемиологические особенности вирусных гепатитоваиев организованных... Ведущее учреждение гу научно-исследовательский институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. Чумакова М. П. Рамн |
| Реферат отчета По Государственный контракту №47 от 31. 03. 2008 г.... ... | | «инфекционные болезни» ... |
