Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций

Рис. 9А Рис. 9Б Рис. 9В Рис. 9. Филогенетические деревья для изученных последовательностей вируса паротита, (А) – по SH-гену (сравнение с референс-штаммами), (Б) - по полным нуклеотидным последовательностям генома вируса, (В) – по М-гену. Принятое обозначения штамма: AUS64Jl2 = A- генотип, US- страна выделения (США), 64–год выделения, Jl – сокращенное название штамма (Jeryl-Lynn), 2 – номер деривата штамма (если несколько дериватов одного штамма), Х - неизвестно. CRU94DRA – штамм Драгун, HRU03Pet – штамм ПетроНов. Для изучения возможных изменений в геноме вируса, вызвавших тяжелое течение инфекции и столь длительную циркуляцию вируса в организме больного, из зараженной культуры клеток Vero (3-й пассаж вируса от исходного, выделенного из носоглотки больного) была выделена РНК в достаточном для проведения работ по секвенированию количестве. После секвенирования было проведено выравнивание нуклеотидных последовательностей для 16 полных геномов относительно штамма ПетроНов и построен график плотности распределения в них мутаций (рис. 10). Изученные геномы распределились по последовательностям на три группы. В первую группу попал штамм ПетроНов и наиболее близкий к нему штамм HUSXX881, другая группа, наиболее далекая от названных, представлена тремя вакцинными штаммами Jeryl Lynn (AUS64Jl1, AUS64Jl2, AUS64Jl3), остальные 12 штаммов образуют третью, промежуточную группу. Следует отметить, что точки пересечения кривых для этих трех групп отсутствуют, что говорит об отсутствии явных рекомбинационных механизмов для исследованных штаммов вируса паротита. Филогенетический анализ, как для полных геномов в целом, так и отдельно для каждого гена показал, что между дикими и вакцинными штамммами явных отличий нет (см. рис. 9). С незначительными перестановками внутри подгрупп, деревья для всех генов были схожи и практически повторяют дерево для полного генома (см. рис. 9, Б). Тем не менее, интересно отметить, что филогенетическое дерево отдельно для М-гена отличается от деревьев для всех других генов: штамм ПетроНов попадает в подгруппу вакцинных штаммов А-генотипа; а описанный ранее авторами штамм Драгун по М-гену наиболее близок к вакцинному штамму AUS64Jl2 (см. рис. 9, В). В настоящее время принято генотипировать изоляты вируса паротита по наиболее вариабельному фрагменту генома, включающему С-концевую часть гена F и SH-ген. Выделенный изолят относился к генотипу Н (см. рис. 9, А). Для отнесения выделенного изолята к этому генотипу были использованы референс-штаммы, предложенные в работе L. Jin и соавт. (2005). В результате проведенной работы был выделен и первично охарактеризован новый штамм вируса паротита. Штамм получил название ПетроНов и был депонирован в коллекцию микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор" (номер  V-330). Полная нуклеотидная последовательность штамма была депонирована в базу данных GenBank (№ AY681495). NP P(V/I) M F SH HN L → гены вируса Рис. 10. Плотность вариабельности для 16 полных геномов вируса паротита относительно штамма ПетроНов. Окно расчета 1500 н.о., шаг - 20 н.о. Принятое обозначения штамма: AUS64Jl2 = A- генотип, US- страна выделения (США), 64–год выделения, Jl – сокращенное название штамма (Jeryl-Lynn), 2 – номер деривата штамма (если несколько дериватов одного штамма), Х – неизвестно. В результате проведенных исследований впервые на территории России (Западная Сибирь) была показана циркуляция 2 генотипов вируса паротита – С и Н. Таким образом, проведены молекулярно-эпидемиологические исследования, позволившие выявить основные генотипы вирусов кори и паротита, циркулирующие на территории Западной Сибири. Показана циркуляция генотипа D6 вируса кори в России и циркуляция генотипов С и Н вируса паротита. Выделенные изоляты этих генотипов позволили изучить основные свойства новых генотипов этих вирусов. ВЫВОДЫ Разработана и запатентована технология получения концентрированных препаратов вируса Марбург из культуральной вируссодержащей жидкости в соответствии с принципами обеспечения биологической безопасности в вирусологических лабораториях. На экспериментальных лабораторных животных (белые мыши, морские свинки) изучены иммуногенные и протективные свойства основных структурных белков вируса в сравнении с инактивированным препаратом вируса Марбург. При этом установлено: а) препарат нативного белка NP, полученный методом обращенно-фазовой хроматографии, вызывает образование вирусспецифических антител, стимулирует развитие специфического клеточного иммунитета и защищает животных от введения летальных доз вируса Марбург (коэффициент защиты К.З. = 47 + 12 %¥, 70 + 14 %£), б) препарат нативного белка VP40, полученный методом обращенно-фазовой хроматографии, вызывает образование вирусспецифических антител, стимулирует развитие специфического клеточного иммунитета и защищает животных от введения летальных доз вируса Марбург (К.З.= 0 %¥, 16 + 8 %£), в) препарат рекомбинантного белка GP, полученный в бакуловирусной системе, вызывает образование вирусспецифических антител, стимулирует развитие специфического клеточного иммунитета и защищает животных от введения летальных доз вируса Марбург (К.З.= 16 + 6 %)¥, г) рекомбинантный белок GP в составе осповакцины вызывает образование вирусспецифических антител, стимулирует развитие специфического клеточного иммунитета, но не защищает животных от введения летальных доз вируса Марбург (К.З.= 0 %)¥, в) препарат рекомбинантного белка VP24, полученный в бакуловирусной системе, вызывает образование вирусспецифических антител, стимулирует развитие специфического клеточного иммунитета и защищает животных от введения летальных доз вируса Марбург (К.З.= 14 + 4 %)¥, Предложены и обоснованы новые способы доставки живой коревой вакцины и создания рекомбинантных препаратов. При этом установлено: а) использование таблетированной и инкапсулированной форм живой коревой вакцины для перорального применения вызывает у кроликов появление специфических антител к вирусу кори, б) введение живой коревой вакцины в просвет тонкого отдела кишечника обезьяны приводит к появлению специфических антител классов M, A и G, а также нейтрализующих антител, в) при введении кандидатной ДНК вакцины на основе белка H вируса кори у мышей формируется специфический гуморальный и клеточный ответ. На основе выделеного изолят вируса кори (штамм НовО96) разработана и после государственных испытаний и испытаний в сети лабораторий ВОЗ внедрена в практику здравоохранения «Тест-система иммуноферментная для определения антител класса G к вирусу кори» с регистрацией результатов в МЕ. В рамках программы элиминации кори проведены работы по изучению коллективного иммунитета в различных возрастных группах населения, выявлена группа (возраст 16-25 лет) с наибольшим количеством серонегативных лиц. Разработана «Тест-система иммуноферментная для определения антител класса М к вирусу кори», использованием собранной и аттестованной панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса М к вирусу кори, подтверждена ее эффективность. На основе выделенного изолята вируса паротита (штамм Драгун) разработана «Тест-система иммуноферментная для определения антител класса G к вирусу паротита». Показана циркуляция генотипа D6 вируса кори и генотипов C и H вируса паротита на территории РФ. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикации основных результатов диссертации Стрельцова М.А., Агафонов А.П., Игнатьев Г.М. Чувствительность культур клеток различных линий к вирусу Марбург // Вопр. вирусол.– 1991.– N. 5.– C.437-438. Игнатьев Г.М., Стрельцова М.А, Агафонов А.П., Кузьмин В.А. и др. Сравнительное изучение некоторых иммунологических показателей при введении инактивированного вируса Марбург морским свинкам // Вопр. вирусол.– 1991.– N. 2.– C.421-423. Лавриненко И.А., Агафонов А.П. Изучение функциональной активности лимфоцитов у людей, вакцинированных против геморрагической лихорадки Марбург // Иммунология .– 1993.– N. 1.– C.34-36. Игнатьев Г.М., Стрельцова М.А., Агафонов А.П. Жукова Н.А., Кашенцева Е.А., Воробьева М.С. Некоторые показатели иммунитета у животных, иммунизированных инактивированным вирусом Марбург, после заражения гомологичным вирусом // Вопр. вирусол.– 1994.– N. 1.– C.13-17. Игнатьев Г.М., Стрельцова М.А., Агафонов А.П. Прозоровский Н.С., Жукова Н.А., Кашенцева Е.А., Воробьева М.С. Иммунологические показатели у морских свинок при моделировании геморрагической лихорадки Марбург // Вопр. вирусол. – 1994.– N. 5.– C.169-171. Игнатьев Г.М., Стрельцова М.А., Агафонов А.П., Кашенцева Е.А. Механизмы протективного иммунного ответа при моделировании лихорадки Марбург на обезьянах // Вопр. вирусол. – 1995.– N. 3.– C.109-113. Агафонов А.П., Калиберов С.А., Патрушева И.В., Ничеухина С.Н., Перебоева Л.А., Игнатьев Г.М. Изучение иммуно-биологических свойств штаммов вируса паротита // Вопр. вирусол.– 1995.– N. 3.– C.115-119. Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Streltsova M.A., Kashentseva E.A. Inactivated Marburg virus elicits a nonprotective immune response in Rhesus monkeys //J. Biotechnol.– 1996.– N. 44.– P.111-118. Игнатьев Г.М., Стрельцова М.А., Агафонов А.П., Кашенцева Е.А., Прозоровский Н.С. Экспериментальное изучение возможности лечения геморрагической лихорадки Марбург десфералом, рибавирином и гомологичным интерфероном // Вопр. вирусол.– 1991.– N. 5.– C.206-209. Агафонов А.П., Игнатьев Г.М., Патрушев Н.А., Ничеухина С.Н., Рябчикова Е.И., Денисов С.И., Блинов В.М.. Выделение сибирского изолята вируса паротита // Вопр. вирусол.– 1997.– N. 5.– C.222-226. Агафонов А.П., Ничеухина С.Н., Мерзликн Н.В., Кломакова Е.А., Гончаров А.Н., Майданюк А.Г., Игнатьев Г.М. Сравнительное изучение методов определения антител к вирусу кори // Вопр. вирусол.– 1997.– N. 1.– C.44-47. Santibanez S., Heider A., Gerike E., Agafonov A., Schreier E. Genotyping of measles virus isolates from Central Europe and Russia // J. Med. Virol. – 1999.– Vol. 58. –N. 3.– P.313-320. Полтавченко А.Г., Агафонов А.П., Ничеухина С.Н., Караваев В.С., Игнатьев Г.М. Использование иммуносуспензий на основе угля для определения антител к вирусу паротита методом дот-иммуноанализа // Биотехнология. – 1999.– N. 3.– C.86-91. Ignatyev G., Steinkasser A., Streltsova M., Atrasheuskaya E., Agafonov A., Lubitz W. Experimental study on the possibility of treatment of some hemorrhagic fevers // J. Biotechnol. – 2000.– N. 83.– P. 67-76. Агафонов А.П., Стрельцова М.А., Суслопаров И.М., Игнатьев Г.М. Иммунологические показатели у больных эпидемическим паротитом // Вопр. вирусол. – 2001.– N. 4.– C.30-33. Колокольцов А.А., Давидович И.А., Стрельцова М.А., Агафонов А.П. Использование препаратов интерферона для экстренной профилактики геморрагической лихорадки Марбург на модели обезьян // Бюлл. экспер. биол. – 2001.– N. 7.– C.88-91. Stittelaar K.J., de Swart R.L., Vos H.W., van Amerongen G., Agafonov A.P., Nechaeva E.A., Osterhaus A.D. Enteric administration of a live attenuated measles vaccine does not induce protective immunity in a macaque model // Vaccine. – 2002.– Vol. 20. –N. 23-24.– P.2906-2912. Agranovski I. E., Safatov A. S., Borodulin A. I., P'ankov O. V., Petrishchenko V. A., Sergeev A. N., Agafonov A. P., Ignatiev G. M., Grinshpun S.S. Agranovski V. New personal sampler for viable airborne viruses: feasibility study // J. Aerosol Science. – 2003.– Vol. 34.– P.581-592. Агафонов А.П., Каменева С.Н., Агафонова О.А., Неверов А.А., Игнатьев Г.М. Изучение вирусологических и иммунологических показателей у больных рассеянным склерозом // Вестник РАМН. – 2004.– N. 8.– C.3-6. Максимов Н.Л., Букин Е.К., Агафонов А.П., Неверов А.А., Карпенко Л.И., Ильичев А.А., Игнатьев Г.М. Противокоревая ДНК-иммунизация в эксперименте: иммуногенность и безопасность // Вопр. вирусол. – 2005.– N. 1.– C.4-8. Агафонов А.П., Игнатьев Г.М., Свистов В.В., Смирнов И.В., Кривошеин Ю.С. Изучение in vitro антивирусных свойств Мирамистина в отношении вирусов кори и паротита // Антибиотики и химиотерапия. – 2005.– N. 5-6.– C.17-19. Агафонов А.П., Неверов А.А., Каменева С.Н., Сараев Д.В., Гинько З.И., Блинов В.М., Чумаков К.М., Игнатьев Г.М., Зверев В.В. Выделение, генотипирование и анализ полной нуклеотидной последовательности сибирского изолята вируса паротита // Эпидемиол. и вакцинопрофилакт. – 2007.– N. 5.– C.34-41. Agranovski I.E., Safatov A.S., Agafonov A.P. Pyankov O.V., Sergeev A.N. Monitoring of airborne mumps and measles viruses in a hospital // Clean. – 2008.– Vol. 36. –N. 10-11.– P.845-849. Работы, опубликованные в сборниках научных трудов, материалах конференций и других изданиях: Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Твердохлебов А.В., Стрельцова М.А. и др. Изучение иммуногенности инактивированных вирусов Марбург и Мачупо// В кн: Итоги науки и техники. Серия "Вирусология", "Арбовирусы и арбовирусные инфекции". М. 1991 г, С.18-22. Agafonov A.P., G.M.Ignatyev, Z.A.Akimenko, V.E.Volchkov. Study of immunogenic and protective properties of Marburg virus GP, NP and VP40 protein// Abstracts IXth International congress of virology.- Glasgow Scotland.- 1993.- P52-7.- p.300. Ignatyev G.M., Volchkov V.E, Blinov V.M., Samukov V.V., Agafonov A.P., Streltsova M.A., Kashentseva E.A. Phenomenon of immunosupression caused by Filoviruses // Intern. J. Immunorehabilitat, – 1994.– N. 1(Supp).– C.78-79. Agafonov A.P., Streltsova M.A., Kashentseva E.A., Ignatyev G.M. Possible mechanism of immunosuppression for filoviruses infection // Intern. J. Immunorehabilitat, – 1994.– N. 1(Supp).– C.86-87. Ignatyev G.M., Streltsova M.A., Agafonov A.P., Kashentseva E.A. Immunity indeces in the personnel involved in Marburg virus investigation // Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. – 1996.– Vol. 90. –N. 5.– P.472. Becker S., Volchkov V. E., Muhlberge E., Klenk H.-D., Agafonov A.P., G.M.Ignatyev. A recombinant vaccina virus expressing the surface protein of Marburg virus does not protected guinea pigs against Marburg-virus infection // Abstracts Xth International congress of virology.- Ierusalem, Israel.- 1996, PW 60-40, P. 259 Nechaeva E.A., Varaksin N.A., Rjabicheva T.A., Kolokoltsova T.D., Ignatiev G.M., Agafonov A.P. Development of production technology of live measles vaccine for peroral administration. Animal Cell Technology: from Vaccine to Genetic Medicine, Kluwer Academic Publishers, M.J.T. Carrondo (eds), 1997, Р.197-202. Ignatyev G.M., Streltsova M.A., Kashentseva E.A., Patrushev N.A., Ginko S.I., Agafonov A.P. Immunity indexes in the personnel involved in haemorrhagic virus investigation. // In book: Proceedings of the 1996 ERDEC Scientific Conference on Chemical and Biological Defense Research. Ed. D.A.Berg, 1997., Aberdeen Proving Ground, MD 21010-5423, P. 323-330. Nechaeva E.A., Kashentseva E.A., Agafonov A.P., Varaksin N.A., Bondarenko V.N., Konstantinov A.P., Kitz I.V., Senkina T.Y., Zhilina N.V. New form of the live measles vaccine for oral administration. Animal Cell Technology: New Developments-New Application, Kluwer Academic Publishers, 1998, Р.573-575.

Похожие:

	Тема: патогенные кокки Овладеть основными методами лабораторной диагностики, терапии и профилактики кокковых инфекций		Паразитарные инфекции у детей Овладение знаниями, умениями и навыками в области природно-очаговых и паразитарных инфекций у детей, включающими этиологию, эпидемиологию,...
	Международный Фестиваль Культуры и Искусства Естественные науки Опытно-экспериментальная... Я решил писать данную работу, чтобы узнать побольше об истории появления тригонометрии, способах решения тригонометрических уравнений...		Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств... ...
	Носитель антигенов Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии. Предлагается носитель антигенов в виде липидного комплекса, состоящего из гликозида,...		Некоторые аспекты диагностики tоrch-инфекций в акушерстве Коханского ул., д. 7, г. Чита, 672038, тел. 31-43-23, факс. (302-2) 31-43-24
	Использование презентации на уроке немецкого языка Данное методическое пособие предназначено для специалистов системы профилактики правонарушений несовершеннолетних, их реабилитации...		Клинико-эпидемиологическая характеристика парентеральных вирусных... Работа выполнена в гу нии эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи рамн г. Москва и на кафедре акушерства и гинекологии гоу...
	Выпускная работа по «Основам информационных технологий» Интерфероны являются многофункциональными компонентами защиты против вирусных и паразитарных инфекций и некоторых опухолей. Они влияют...		Московский энергетический институт (технический университет) Целью дисциплины является получение знаний о современных методах радиоизмерений, о возможностях современной контрольно-измерительной...
	Ротавирусная инфекция у детей: серьезное заболевание Ротавирус – очень заразная группа вирусных инфекций, чаще всего поражающих детей в возрасте от шести месяцев до двух лет. Основные...		эпидемиологическая характеристика внутрибольничных гепатитов в и... Институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л. В. Громашевского амн украины, заведующий лабораторией вирусных гепатитов и...
	Городского округа красноуфимск постановление О внесении изменений в постановление главы городского округа Красноуфимск №43 от 24. 01. 2011 года «Об утверждении комплексного плана...		Эпидемиологические особенности вирусных гепатитоваиев организованных... Ведущее учреждение гу научно-исследовательский институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. Чумакова М. П. Рамн
	Реферат отчета По Государственный контракту №47 от 31. 03. 2008 г.... ...		«инфекционные болезни» ...