Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций
Скачать 0.75 Mb.
|
Получение антигена вируса паротита и разработка средств диагностики на его основе. Для разработки иммуноферментной тест-системы были использованы референс-штамм Эндерс и штамм Драгун, выделенный при вспышке заболевания эпидемическим паротитом в р.п. Кольцово Новосибирской области в январе-июне 1994 года. Вирус паротита был очищен ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы из КВЖ и лизата зараженных клеток. Фракции, собранные с градиента плотности сахарозы после ультрацентрифугирования, были изучены в реакции гемагглютинации с эритроцитами обезьяны Macaca mulatta. Вирус обладал типичной для паротита способностью агглютинировать эритроциты обезьяны. Результаты анализа фракций в РГА приведены на рисунке 7, А. Концентрирование вируса из культуральной вируссодержащей жидкости позволило получить вирус в препаративных количествах уже после однократного ультрацентрифугирования. Изучение препаратов методом электронной микроскопии показало, что в очищенных препаратах находятся вирионы и нуклеокапсиды с характерной для вируса паротита структурой. Для подтверждения принадлежности выделенного изолята Драгун к вирусу паротита из КВЖ была выделена суммарная РНК, синтезирована кДНК и проведена ПЦР. Для проведения полимеразной цепной реакции были использованы пары праймеров, перекрывающие районы генома в области, кодирующей участки генов F- и SH-белков (позиции 5276 – 5785 указаны для фрагмента кДНК вируса паротита, штамм SBL, изолят SBL-1). Расчетный размер данного участка с учетом включенных в праймеры сайтов для рестриктаз составляет 548 нуклеотидов, что соответствовал размеру ампликона. Первичная структура праймеров для фрагмента, соответствующего концу F-гена и SH-гену, приведена ниже: F primer - TTGGATCCTTGTAGCAGCCTTAGTTTTGAG, R primer – CGGAATTCTGCTTTTTTCTTTATGTCTCATG. Секвенирование амплификационного фрагмента показало принадлежность штамма Драгун к вирусу паротита.
Рис. 7. Получение и изучение антигена вируса паротита. (А) - Анализ фракций вируса паротита после центрифугирования в градиенте плотности сахарозы в РГА. (Б) - Электрофорез белков вируса паротита, шт. Эндерс. Дорожки 1 и 4- маркеры мол. весов: 66, 45, 36, 18 кД. Дорожка 3 – белки вируса паротита. Стрелками указаны: белок NP (верхняя полоса), М (нижняя полоса) вируса паротита. Для разработки ИФА-тест-системы выбрали штамма вируса паротита с такими характеристиками как высокая репродуктивность штамма, антигенное родство (высокая серологическая перекрываемость) с другими штаммами вируса паротита, природное происхождение из географического региона проведения будущих исследований. Штаммы Эндерс, Л-3, Jeryl-Linn и Драгун вируса паротита использовали для получения препаративных количеств антигена. Штаммы культивировали на монослое культур клеток: ФЭК, Vero, CV-1, FRhK и Л-68. После культивирования собирали КВЖ и клеточный лизат для определения титра вируса. При получении урожая значительная часть вируса остается связанной с клеточными структурами, поэтому оставшиеся после слива КВЖ клетки разрушали замораживанием-оттаиванием, клеточный детрит осаждали низкоскоростным центрифугированием и надосадочную жидкость собирали. Результаты определения титра вируса паротита в КВЖ и клеточном лизате приведены в таблице 8. Как видно из данных таблицы 8 штаммы вируса паротита размножались во всех клеточных культурах. Максимальные титры вируса паротита достигались на 5-6 сут после заражения монослоя клеток Vero и для штамма Эндерс составляли 6,32 + 0,29 lg ТЦД50/мл, а для штамма Драгун – 7,93 + 0,49 lg ТЦД50/мл. Таблица 8 Определения чувствительности культур клеток к вирусу паротита при стационарном способе культивирования
н.о. - титр вируса не определяли. Для выбора антигена были взяты сыворотки лабораторных животных, любезно предоставленные к.б.н. Т.Н. Юнасовой (ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Использование для сорбции на планшет фракций с цельным вирусом штамма Эндерс, выделенным из КВЖ, в отличие от использования фракций, выделенных из лизата клеток, инфицированных штаммом Эндерс (фракции, обогащенные нуклеокапсидами), повышает чувствительность реакции (табл. 9). Максимальные титры противокоревых антител выявлялись при использовании для сорбции на планшет антигена на основе штамма Драгун. По этой причине в качестве иммуносорбента для ИФА был выбран суммарный антиген на основе штамма Драгун, полученный смешиванием фракций, выделенных на градиенте плотности сахарозы при очистке КВЖ и лизата зараженных вирусом клеток, в пропорции 1:2 – 1:3. Таблица 9 Определение титра антител в сыворотках крови лабораторных животных
* 1 - сыворотка кролика, иммунизированного цельным вирусом (получена из ГИСК им.Тарасевича); 2 - сыворотка кролика, иммунизированная очищенным нуклеокапсидом из лизата клеток; 3 - нормальная кроличья сыворотка; 4 - сыворотка крысы, иммунизированной цельным вирусом (получена из ГИСК им. Тарасевича). ** - в качестве антигенов использованы суммарные (цельный вирус и нуклеокапсиды) фракции, собранные с градиента плотности сахарозы. В препарате очищенного инактивированного антигена определяли общий белок методом Лоури (Lowry O.H. et al., 1951). Исходя из концентрации белка, на карбонатно-бикарбонатном буфере (рН=9.6) готовили разведения препарата, содержащего 0,5; 1,0; 4,0 и 10,0 мкг/мл антигена вируса паротита, и вносили его по 100 мкл в лунки 96-луночных планшетов (Nunс, США). Показано, что 0,4 мкг препарата на лунку является оптимальной дозой антигена вируса паротита, обеспечивающей максимальные различия между положительными и отрицательными сыворотками (рис. 8). Далее был проведен подбор оптимального разведения конъюгата и изучены сроки хранения тест-системы для определения антител класса G к вирусу паротита.  Рис. 8. Определение оптимальной концентрации антигена вируса паротита для постановки ИФА. По оси ординат показана разница соответствующих оптических плотностей положительного и отрицательного образцов. Для выявления корреляции при определении титров антител между методами ИФА и РТГА были использованы сыворотки мышей линии BALB/c, иммунизированных очищенным вирусом паротита. Очищенный вирус паротита штаммов Эндерс и Драгун вводили животным внутрикожно трехкратно с интервалом 16 сут в дозе 50 мкг/животное, используя при первой иммунизации полный адъювант Фрейда, а при повторных – неполный адъювант Фрейда. Определение титра антител проводили через 21 сут после последней иммунизации. Результаты экспериментов приведены в таблице 10. Использование разработанной ИФА-тест-системы позволяет выявлять антитела в сыворотках крови животных, в титрах более высоких, чем это возможно в РТГА. С помощью разработанной ИФА-тест-системы использовали для выявления антител класса G в сыворотках крови людей, вакцинированных живой паротитной вакциной или переболевших эпидемическим паротитом разной степени тяжести. Всего в работу взяли сыворотки 41 пациента. Результаты анализа сывороток на содержание противопаротитных антител методом ИФА сравнивали с результатами, полученными в РТГА. Значения титров антител в исследуемых сыворотках крови людей, определенных с помощью тест-системы, коррелировало со значениями титров антител в этих сыворотках, определенных в РТГА. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | Тема: патогенные кокки Овладеть основными методами лабораторной диагностики, терапии и профилактики кокковых инфекций |  | Паразитарные инфекции у детей Овладение знаниями, умениями и навыками в области природно-очаговых и паразитарных инфекций у детей, включающими этиологию, эпидемиологию,... |
| Международный Фестиваль Культуры и Искусства Естественные науки Опытно-экспериментальная... Я решил писать данную работу, чтобы узнать побольше об истории появления тригонометрии, способах решения тригонометрических уравнений... | | Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств... ... |
| Носитель антигенов Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии. Предлагается носитель антигенов в виде липидного комплекса, состоящего из гликозида,... | | Некоторые аспекты диагностики tоrch-инфекций в акушерстве Коханского ул., д. 7, г. Чита, 672038, тел. 31-43-23, факс. (302-2) 31-43-24 |
| Использование презентации на уроке немецкого языка Данное методическое пособие предназначено для специалистов системы профилактики правонарушений несовершеннолетних, их реабилитации... | | Клинико-эпидемиологическая характеристика парентеральных вирусных... Работа выполнена в гу нии эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи рамн г. Москва и на кафедре акушерства и гинекологии гоу... |
| Выпускная работа по «Основам информационных технологий» Интерфероны являются многофункциональными компонентами защиты против вирусных и паразитарных инфекций и некоторых опухолей. Они влияют... | | Московский энергетический институт (технический университет) Целью дисциплины является получение знаний о современных методах радиоизмерений, о возможностях современной контрольно-измерительной... |
| Ротавирусная инфекция у детей: серьезное заболевание Ротавирус – очень заразная группа вирусных инфекций, чаще всего поражающих детей в возрасте от шести месяцев до двух лет. Основные... | | эпидемиологическая характеристика внутрибольничных гепатитов в и... Институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л. В. Громашевского амн украины, заведующий лабораторией вирусных гепатитов и... |
| Городского округа красноуфимск постановление О внесении изменений в постановление главы городского округа Красноуфимск №43 от 24. 01. 2011 года «Об утверждении комплексного плана... | | Эпидемиологические особенности вирусных гепатитоваиев организованных... Ведущее учреждение гу научно-исследовательский институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. Чумакова М. П. Рамн |
| Реферат отчета По Государственный контракту №47 от 31. 03. 2008 г.... ... | | «инфекционные болезни» ... |
