1.2 Метаболизм полиаминов
Повсеместное распространение ПА в биологическом материале: микроорганизмах, растениях и животных – указывает на то, что эти соединения, вероятно, выполняют существенные функции в обмене веществ у живых организмов. Следует отметить, что метаболизм ПА тесно связан со многими обменными процессами, и, прежде всего, с обменом аминокислот. Все три полиамина сунтезируются в организме из L-аргинина и L-метионина. Путресцин образуется путем декарбоксилирования орнитина под действием фермента орнитиндекарбоксилазы (ОДК). Путресцин присоединяет аминопропильные группы, образованные декарбоксилированием S-аденозил-метионина, последовательно образуя сначала спермидин, а потом спермин. Спермидин- и спермин-синтазы катализируют эти реакции синтеза спермидина и спермина, соответственно.
Существует также процесс обратного превращения – интерконверсия. Спермин расщеплялся до спермидина, а последний до путресцина. Механизм реакции проходит в 2 стадии:
1. В реакции ацетилирования спермина и спермидина с участием ацетилтрансферазы образуются ацетилпроизводные полиаминов, которые обычно секретизируются клеткой [269]. В опухолевых клетках, наоборот, уровни ацетилполиаминов остаются высокими. Это подтверждает факт корреляционной зависимости между полиаминами и опухолевыми процессами [143, 54, 194].
2. Ацетил-производные представляют собой субстрат для активации полиаминоксидазы (ПАО), под действием которого они окисляются до спермидина и путресцина [72, 73]. Окислению полиаминов сопутствует образование пероксида водорода и аминоальдегидов в больших количествах. Они оказываюттоксическое воздействие на клетку, которое может привести к ее гибели.
1.3 Пути синтеза полиаминов и роль орнитиндекарбоксилазы
ПА образуются в результате декарбоксилирования аминокислот, и их метаболизм тесно связан со многими важными метаболическими превращениями последних. В тканях животных путресцин образуется при декарбоксилировании L-oрнитина L-орнитиндекарбоксилазой (ОДК; КФ 4.1.1.17). Как видно из рисунка 2, путресцин служит исходным материалом для биосинтеза спермидина и спермина. При этом также необходимы метионин и аденозинтрифосфат (АТФ). Метионин, прежде чем он используется для биосинтеза спермидина и спермина, взаимодействует с АТФ с образованием S-аденозил-L-метионина (S-AM). Декарбоксилирование S-АМ катализируется ферментом S-аденозил-L-метиониндекарбоксилазой (S-АМДК; КФ 4.1.1.50). Декарбоксилированный S-АМ снабжает аминопропиловыми группами ферментативный биосинтез полиаминов, осуществляемый двумя синтазами: спермидинсинтазой и сперминсинтазой.
Рисунок 2 - Схема обмена полиаминов в клетках млекопитающих.
Спермидинсинтаза катализирует образование спермидина путем присоединения к путресцину одной аминопропиловой группы. Сперминсинтаза добавляет другую такую же группу к спермидину. В результате этого образуется спермин. Протекание этих аминопропилтрансферазных реакций регулируется запасом их субстратов. S-АМ является донором метильных групп при метилтрансферазной реакции. Нормальное содержание в клетке декарбоксилированного S-АМ очень низкое (в печени приблизительно 1,5 нмоль/г влажной ткани) и составляет 1-5 % содержания S-АМ. Но оно увеличивается в 300-500 раз, если содержание путресцина и спермидина в клетке снижается. Во всех тканях животных активность спермидин- и сперминсинтаз во много раз выше активностей обеих декарбоксилаз. Поэтому синтез полиаминов лимитируется активностями ОДК и S-АМДК [19, 26, 27].
1.3.1 Орнитиндекарбоксилаза
Ключевую роль в биосинтезе полиаминов играет ОДК. Как и другие декарбоксилазы, ОДК является пиридоксальсодержащим ферментом, требующим для проявления своей активности наличия тиоловых групп. Фермент локализуется в цитозоле и в ядрах клеток и декарбоксилирует L-орнитин, но не Д-орнитин. Км для L-орнитина 0,1-0,2 мМ. ОДК – один из самых быстрообменивающихся ферментов животных. Период ее полужизни (t1/2) в нормальных тканях составляет 10-30 минут. Замечательным свойством ОДК является ее высокая индуцибельность, впервые описанная при развитии куриного эмбриона, регенерации печени и при действии на печень гормона роста [167, 168, 253]. Быстрое и значительное (от 10 до 200 раз) увеличение активности ОДК установлено в опытах in vivo на изо лированных органах и клетках при различных физиологических и фармакологических стимулирующих воздействиях [1, 168]. Индукция ОДК – одно из самых ранних молекулярных проявлений активированного метаболизма клетки, готовящейся к дифференцировке, росту и делению или активному выполнению специализированной функции. Особенно показательна в этом отношении гормональная регуляция активности ОДК в клетках органов-мишеней. Так, при гипофизэктомии у крыс резко снижается содержание спермидина в печени, а при введении гормона роста уровень его нормализуется [1, 19]. Гормон роста активирует ОДК, при этом в печени накапливается путресцин. Это ведет к активизации биосинтеза спермидина.
Стимулятором активности ОДК печени, почек и надпочечников является адренокортикотропный гормон (АКТГ). Активацию ОДК почек крыс вызывают также глюкокортикоиды. Одним из доказательств участия гонадотропного гормона в регуляции метаболизма полиаминов служит его зависимость от эстральных циклов. Активность ОДК матки молодых крыс возрастает в несколько раз при введении эстрогенов. Молекулярная масса ОДК печени крыс 105 000 Да. При ПАГ-электрофорезе в денатурирующей системе, содержащей додецилсульфат натрия, фермент представлен одной субъединицей с молекулярной массой 55000 Да (ОДК печени крыс) и 53 000 Да (ОДК почек мышей). Описаны различные молекулярные формы ОДК, обнаруживаемые в регенерирующей печени, в печени крыс, получающих канцерогенные вещества, в различных клетках, растущих в культуре, у низших эукариотов и бактерий. Так, например, в культивируемых фибробластах при экспоненциальной фазе роста обнаружены две формы ОДК, отличающиеся по чувствительности к пиридоксаль-51-фосфату, но без заметных различий в Км для L-орнитина и одинаковым периодом полужизни. В ткани сердца крыс после введения изопротеренола наблюдали появление формы фермента с увеличенным сродством к субстрату. Падение активности ОДК в сердце крыс сопровождалось исчезновением этой молекулярной формы фермента. Сравнительное кинетическое изучение активности ОДК мозга и печени крыс показало, что ОДК мозга имеет более высокую чувствительность к субстрату, чем ОДК печени. Взаимоотношения различных молекулярных форм ОДК с повышенным сродством к субстрату или к коферменту не ясны. В настоящее время нет убедительных данных, являются ли множественные молекулярные формы ОДК различными продуктами транскрипции (т.е. изоэнзимами) или они появляются в результате посттрансляционных превращений фермента [1, 19]. «Драматическое» увеличение активности ОДК наблюдается в печени животных впервые часы регенерации. Эффективными стимулами, вызывающими подъем ОДК, являются ростовые факторы (эпидермальный фактор роста), активация лимфоцитов, трансформация клеток онкогенными вирусами, добавление свежей содержащей сыворотку среды к покоящимся клеткам, изменение ионного состава среды, введение канцерогенных веществ и промоторов опухолевого роста (форболовых эфиров) и др. [19]. Содержание ОДК в нестимулированных тканях животных очень низкое (исключением является предстательная железа). Поэтому выделение фермента из различных органов производят обычно после индукции в них ОДК. Для этой цели чаще всего используют почки мышей, которым вводили андрогены, в сотни раз увеличивающие содержание ОДК в этом органе. Но даже в этом случае ОДК составляет лишь 0,01% почечного белка. В печени крыс ОДК можно индуцировать тиоацетамидом и α-гидразин-β-аминовалериановой кислотой. После индукции тиоацетамидом ОДК составляет 0,0003% общего белка печени крыс, и для получения гомогенного препарата требуется очистка в 350 000 раз. Из этих органов ОДК выделена и очищена до гомогенного состояния [1].
Механизмы, которые регулируют уровень активности ОДК в клетке, полностью не расшифрованы. Предполагается несколько возможностей. Это может быть изменение скорости синтеза фермента, включая механизм амплификации генов ОДК, изменение скорости ее деградации, образование макромолекулярных ингибиторов и активаторов, а также посттрансляционная модификация [47]. В большинстве исследованных биологических систем индукция активности ОДК является результатом синтеза новых молекул фермента, а не активации предсуществующих молекул. Это заключение сделано на основании данных о том, что индукция ОДК не происходит или значительно ослабляется при применении ингибиторов синтеза белка и РНК. Прямое доказательство увеличения количества ОДК при ее индукции получено в опытах с использованием специфических антител. Однако в ряде случаев индукция ОДК резистентна к действию актиномицина Д, что свидетельствует о том, что образование новых мРНК для ОДК регулируется раздельно на транскрипционном и трансляционном уровнях. Количество фермента при стимулирующих воздействиях увеличивается также благодаря стабилизации ОДК (t1/2 увеличивается в 4-10 раз) [1, 19].
Из внутриклеточных контролирующих механизмов в настоящее время большое внимание уделяется изучению ингибиторов ОДК. Обнаружено, что добавление путресцина к клеточным культурам или инъекции его частично гепатэктомированным крысам, индуцирует образование в клетках или печени ингибитора ОДК, который был назван «ОДК антизимом» [1, 19]. Ингибитор – это белок, чувствительный к протеазам, но не к РНКазам. Его индукция подавляется циклогексимидом, но не актиномицином Д. Это свидетельствует в пользу существования в клетках стабильных мРНК для синтеза этого белка. Антизим ОДК обнаружен в клетках печени животных, которым и не вводили путресцин. В печени крыс (без индукции путресцином) ингибитор локализуется, в осноном, в ядре клеток, но небольшие его количества обнаружены в гладком и гранулярном эндоплазматическом ретикулуме. После индукции путресцином содержание антизима ОДК в цитозоле клеток печени резко увеличивается. Антизим ОДК был получен из цитозольной фракции печени крыс и очищен в 600 000 раз до гомогенного состояния. Были изучены его физико-химические свойства. Очищенный антизим давал одну полосу с молекулярной массой 19 000 Да при электрофорезе в полиакриламидном геле в системе, содержащей додецилсульфат натрия, а молекулярная масса его, определенная методом гельфильтрации на сефадексе G-200, близка к этой величине – 22000 Да [1].
Эти данные показывают, что антизим представляет собой одну полипептидную цепь. Механизм действия ингибитора заключается в образовании комплекса с ОДК, в результате чего теряется ферментативная активность ОДК, и исчезает свободный ингибитор. Взаимодействие ОДК с антизимом in vitro протекает при температуре 0ºС очень быстро, достигая максимума в течение 1 мин. При 37ºС реакция замедляется. Антизим очень лабилен, но стабилизируется твином-80 и 2-меркаптоэтанолом. Связь ОДК с антизимом нековалентная, поэтому комплекс ОДК – антизим может быть разрушен в среде с высоким содержанием солей и выходом активного фермента. Антизим ОДК выделен также из ткани молочных желез и других тканей животных, в частности, культур клеток животных. Физиологическое его значение заключается в быстром изменении активности ОДК. Возможно, антизим играет роль в деградации ОДК. Кроме антизима, из печени крыс выделен белок «активатор ОДК» – антиантизим. Он имеет высокое сходство к антизиму и высвобождает ОДК из комплекса в активной форме. По-видимому, существуют и другие механизмы посттрансляционной модификации ОДК. Так, обнаружено полное исчезновение активности ОДК после 4 часов выращивания S. cerevisiae в среде, содержащей спермидин и спермин.
Количество ферментного белка, определенного методом иммунопреципитации, при этом не уменьшалось, не изменялась его молекулярная масса. В то же время не было получено доказательств ковалентного связывания ОДК с антизимом или полиаминами. Возможно, в инактивации ОДК определенную роль играют специфические протеинкиназы, вызывающие ее фосфорилирование.
Изучению регуляции активности ОДК полиаминами в тканях животных посвящено большое число работ, результаты которых обобщены в обзорах. Синтетические диамины, не содержащиеся в организме в нормальных условиях, могут вызывать снижение активности ОДК в различных тканях крыс in vivo или в культивируемых клетках. Высокие концентрации неорганических катионов (Na+, K+, Mg2+) ингибируют активность ОДК. Механизмы подавления ОДК полиаминами не ясны. Предполагается, что активность ОДК может регулироваться состоянием чувствительных к полиаминам участков клеточной мембраны.
Имеются данные о том, что циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) может быть важным фактором в синтезе полиаминов. Это подтверждается тем, что увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ в фазе G1 сопровождается увеличением активности ОДК. Активность ОДК индуцируется цАМФ и фармакологическими препаратами, которые вызывают увеличение содержания цАМФ в клетках. Например, производные метилксантина, вызывающие рост содержания цАМФ посредством торможения фосфодиэстеразы, увеличивают и активность ОДК. Охлаждение поджелудочной железы крыс, вызывающее повышение уровня цАМФ, также сопровождается увеличением активности ОДК. Все это свидетельствует о важной роли цАМФ в биосинтезе полиаминов. В настоящее время известно, что биохимические и физиологические воздействия цАМФ опосредуются цАМФ–зависимыми протеинкиназами. Увеличение внутриклеточного содержания цАМФ не является обязательным условием для активации цАМФ–зависимой протеинкиназы, так нормальный уровень содержания цАМФ в клетке, по мнению многих исследователей, вполне достаточен для активации всего пула цАМФ–зависимых протеинкиназ. Так, было показано, что введение гормона роста крысам, не увеличивая содержания цАМФ в печени или в органах-мишенях, активирует цАМФ–зависимую протеинкиназу. При гипертрофии печени, вызванной 3-метилхолантреном и фенобарбиталом, также без увеличения содержания цАМФ, возрастает активность цАМФ-зависимой протеинкиназы [274].
Предполагают, что ОДК выполняет двойную функцию: образует необходимый для синтеза ПА путресцин и активирует РНК-полимеразу. Таким образом, внутриклеточная регуляция биосинтеза белка обеспечивается ранней координацией процессов синтеза полиаминов и рибосомных РНК. Так как не во всех случаях индукция ОДК сопровождается последующей активацией РНК-полимеразы-I, по-видимому, имеющаяся взаимосвязь ОДК и метаболизма РНК не всегда реализуется [19].
ОДК занимает центральное место в контроле биосинтеза полиаминов, поэтому изучению этого фермента в последние годы уделяется большое внимание.
|
