1.4.1 Диаминоксидаза
ДАО окисляет путресцин с образованием перекиси водорода, аммиака и иминоальдегида, который спонтанно превращается в пирролин [268]. Необходимость в ионах меди и пиридоксальфосфате [104] обусловливает ингибирующее действие на ДАО медькомплексирующих [55] и карбонильных реагентов [98]. Для очищенного фермента установлены субстратное ингибирование [63], способность действовать только на первичные аминогруппы и широкий, резкощелочной оптимум рН [161]. Это принципиально отличает ДАО от моноаминоксидазы.ДАО, в основном, локализована в микросомальной фракции, поддерживает оптимальные для ростовых процессов концентрации ПА, и тем самым, вероятно, служит одним из факторов регуляции клеточного деления и роста [46]. Так, известно о резком увеличении активности ДАО в матке и плазме крови беременных женщин [1]. Такое же увеличение ДАО обнаружили в плазме крови животных, у которых наивысшая активность фермента наблюдалась на 13-15 день беременности [181]. Аналогичные изменения активности этого фермента в мозге куриного эмбриона коррелировали с содержанием ПА [85]. Максимальной она была на 14-16 дни инкубации, а затем резко падала. Регуляторные свойства ДАО подтверждаются также ее индуцибельностью, которую наблюдали у ряда микроорганизмов [268], а также под действием гепарина в опытах на животных [140] и в перфузированной плаценте человека [263]. Одновременно с регуляторной функцией ДАО, вероятно, выполняет и защитную, устраняя избыток ПА, которые в больших концентрациях проявляют не активирующее, а токсическое действие [51]. Однако наиболее изученным и важным аспектом физиологии этого фермента следует признать ингибирующее действие на клеточный рост продуктов окисления полиаминов. Взаимодействие окисленных полиаминов с ДНК ведет к ингибированию процессов транскрипции in vivo [219] и in vitro [50] и репликации ДНК [179]. В отличие от свободных ПА, которые образуют электростатические связи с ДНК, окисленные продукты этих соединений связываются специфически, необратимо, ковалентно через карбонильную группу со свободными аминогруппами оснований в молекуле ДНК [52]. О возможности регуляторного действия на уровни ПА со стороны аминоксидазы, осуществляющей их распад, говорит и то, что ингибирование ДАО ипрониазидом приводило к аккумулированию ПА и нуклеиновых кислот с одновременным снижением концентрации свободных нуклеотидов [83].
С помощью ингибиторов ДАО показана важная роль окислительного дезаминирования в регуляции обмена ПА. Аминооксидазная активность ферментов крови, расщепляющая ПА, индуцируется у женщин при нормально протекающей беременности как защитная система, ликвидирующая избыток синтезируемых плодом ПА. Максимум активности ДАО приходится на поздние сроки беременности [1].
1.4.2 Полиаминоксидазы
Спермидин- и сперминсинтазные реакции необратимы. Однако возможны внутриклеточные взаимопревращения спермина в спермидин и спермидина в путресцин. Так, парентеральное введение спермина животным приводит к увеличению содержания спермидина в печени и к экскреции его с мочой, а введение спермидина – к возрастанию уровней путресцина в печени. Процесс интерконверсии спермидина, спермина и путресцина обеспечивают ацетил-КоА: полиамин-N1-ацетилтрансфераза (N1=ПАТ, КФ 2.3.1) и полиаминоксидаза (ПАО, КФ 1.5.3.). Фермент имеет очень высокую обмениваемость, лишь немногим меньшую, чем ОДК, что свидетельствует о ее важном физиологическом значении. Ацетилазно/оксидазная система, вероятно, выполняет регуляторную функцию, снижая повышенные внутриклеточные уровни ПА [227, 228]. Данная трансфераза по скорости обмениваемости немногим уступает лишь ОДК. Поэтому ацелирование лимитирует скорость взаимопревращения ПА. Содержание этого фермента в нормальных клетках очень низкое и только в условиях усиления катаболизма ПА, при действии токсических веществ (четыреххлористый углерод, тиоацетамид), при голодании, а также при введении некоторых гормонов (гормон роста, глюкагон) и эндогенного спермидина содержание его быстро и многократно увеличивается [226].
Из печени крыс выделен и охарактеризован единственный флавин – содержащий фермент – полиаминоксидаза (ПАО). N1 – ацетилспермин, N1-ацетилспермидин, N1-, N12-диацетилспермидин являются хорошими субстратами для ПАО, которая расщепляет их в положении вторичной аминогруппы с образованием N-ацетилпропиональдегида и путресцина или спермидина в зависимости от субстрата. ПАО может окислять in vitro и неацетилированные полиамины, но для этого требуются нефизиологические концентрации активаторов. Ацетилированные полиамины быстро окисляются ПАО при физиологических условиях. По-видимому, естественными субстратами ПАО in vivo являются не сами полиамины, а их ацетилированные производные [26].
Второй фермент, участвующий во взаимопревращениях полиаминов – ПАО, не является лимитирующим. В большинстве тканей животных обнаружена высокая активность ПАО, которая обеспечивает быстрое расщепление ацетилированных полиаминов. Поэтому даже в условиях индукции N1-ПАТ, содержание ацетилированных производных полиаминов в тканях низкое. Накопление ацетилированных полиаминов в тканях животных наблюдали при применении ингибиторов ПАО. Инактивация ПАО ингибитором приводит к накоплению в тканях животных N1-ацетилспермидина и N1-ацетилспермина и к снижению концентрации путресцина и спермидина. Поскольку ингибиторы ПАО не влияют на активность других ферментов катаболизма и синтеза полиаминов и не обладают побочным действием, описанные эффекты являются экспериментальной демонстрацией физиологической роли ПАО: окисление N1-ацетилспермина и N1-ацетилспермидина и образование из них спермидина и путресцина соответственно [26].
Другой важный путь катаболизма полиаминов начинается с окислительного дезаминирования их концевых групп – СН2NН2. Многочисленное семейство ферментов – аминооксидазы, обнаруженные в тканях и жидкостях организма животных, в котором выделяют две большие группы: мoноаминооксидазы (МАО – амино: кислород-оксиредуктазы (дезаминирующие) флавин-содержащие, КФ 1.4.3.4), действующие на первичные, вторичные и четвертичные амины, и ДАО. Аминоксидазы, окисляющие путресцин, спермидин и спермин, содержатся в различных тканях: в почках и слизистой оболочке кишечника, в сыворотке крови жвачных и нежвачных животных в период беременности, в сперме, амниотической жидкости, плаценте и т.д. Их выделение и свойства широко известны. Эти ферменты имеют различную субстратную чувствительность. Так, классическая диаминоксидаза почек собак легче всего окисляет путресцин и кадаверин, хуже – спермидин и с трудом – спермин. Из сыворотки крови быка выделен высокоочищенный препарат фермента, названный сперминоксидазой, который катализировал окисление как первичных аминов (бензиламина, бутиламина и др.), так и спермина и спермидина. При окислительном дезаминировании полиаминов образуются лабильные альдегиды – иминоальдегид из спермидина и иминодиальдегид из спермина. Иминоальдегиды, образующиеся при внеклеточном окислении спермина и спермидина, являются биологически активными веществами. В очень малых концентрациях они полностью подавляют рост и размножение бактерий и вирусов, проявляют сильно выраженное антипролиферативное действие по отношению к нормальным и злокачественным клеткам человека и животных.
Установлено ростингибирующее действие полиаминов, окисленных полиаминоксидазой бычьей сывороткой крови, на нормальные и трансформированные фибробласты, клетки асцитного рака Эрлиха, гепатомы Зайдела, лейкоза Швеца и человеческие лейкемические клетки К-562. Авторадиографически показано, что альдегиды полиаминов связываются с плазматическими мембранами клеток [1, 19] продукты окисления полиаминов крайне нестабильны и подвергаются спонтанному распаду. Диокисленный спермин превращается в моноокисленный спермин и акролеин, а моноокисленный спермин – в путресцин и акролеин. Катаболизм путресцина в организме животных и человека осуществляется несколькими путями. Основным для большинства тканей является окислительное дезаминирование путресцина под влиянием диаминоксидазы. Предполагается существование и другого пути катаболизма путресцина, при котором происходит его конверсия в Δ'-пирролин и превращения в 2- пирролидон и 5-гидрокси-2-пирролидон. Этот путь выявлен в печени, селезенке и легких и не обнаружен в мозге, сердце и почках. Кадаверин в тканях животных окисляется ДАО до Δ'-пиперидина с образованием аммония и перекиси водорода [19, 26].
Таким образом, к настоящему времени обмен полиаминов в организме животных изучен довольно полно, выделены, очищены до гомогенного состояния и охарактеризованы три ключевых регуляторных фермента внутриклеточного синтеза и катаболизма полиаминов: ОДК, S-АМДК, ПАТ. Эти ферменты содержатся в клетках в очень маленьких количествах. Так, количество ОДК в печени после индукции составляет 22 000 молекул на клетку, а N1-ПАТ – приблизительно 60 000 молекул. До индукции одна клетка содержит 100-200 молекул ОДК и около 1000 молекул ацетилазы. Регуляторные ферменты имеют высокую скорость деградации по сравнению с другими белками. Период полужизни этих ферментов исчисляется минутами, тогда как период полужизни аминопропилтрансферазы и полиаминоксидазы более 20 час. Быстрый «оборот» этих ферментов обеспечивает быстрое изменение количества ферментного белка и уровня полиаминов в клетке [19, 26].
|
