1.3 Формирование в цитоплазме полостей и апоптотических телец
Плазматическая мембрана клетки начинает образовывать пузырьки, что в отсутствие фагоцитоза приводит к формированию апоптозных телец, содержащих конденсированные или морфологически неизмененные органеллы. Формируются глубокие впячивания поверхности с образованием полостей, что приводит к фрагментации клетки и формированию окруженных мембраной апоптотических телец, состоящих из цитоплазмы и плотно расположенных органелл, с или без фрагментов ядра.
Фагоцитоз апоптотических клеток или телец осуществляется окружающими здоровыми клетками, или паренхиматозными, или макрофагами. Апоптотические тельца быстро разрушаются в лизосомах, а окружающие клетки либо мигрируют, либо делятся, чтобы заполнить освободившееся после гибели клетки пространство. Фагоцитоз апоптотических телец макрофагами или другими клетками активируется рецепторами на этих клетках: они захватывают и поглощают апоптотические клетки. Один из таких рецепторов на макрофагах – рецептор витронектина, который является интегрином и активирует фагоцитоз нейтрофилов.
Рисунок 1 - Последовательность ультраструктурных изменений при апоптозе (справа) и некрозе (слева). 1 – нормальная клетка; 2 – начало апоптоза; 3 – фрагментация апоптотической клетки; 4 – фагоцитоз апоптотических телец окружающими клетками; 5 – гибель внутриклеточных структур при некрозе; 6 – разрушение клеточной мембраны.
Таким образом, отличительной морфологической чертой апоптоза является коллапс ядра. Хроматин, который в норме представлен открытыми и конденсированными областями (гетеро- и эухроматин), становится суперконденсированным в форме полумесяца по периферии ядра. Кроме того, важной особенностью этого процесса является то, что не происходит повреждения мембран клетки. «Усыхание» хорошо выражено как в культуре клеток, так и в тканевых срезах, где апоптотическая клетка отделяется от соседних клеток. Далее апоптотическая клетка превращается в совокупность окруженных мембраной апоптозных телец различных по своему составу, которые фагоцитируются макрофагами или соседними клетками. Клетка на данном этапе еще живая (включение летального красителя трипанового синего не происходит). Видимо в этом и есть задача апоптоза - утилизация еще живых апоптозных телец, пока содержимое клетки не попадает во внеклеточную среду, не вызывая воспалительных явлений т.е. уничтожение клеток путем апоптоза обеспечивает минимальное повреждение тканей по сравнению с другими механизмами смерти.
1.4 Механизмы апоптоза
1.4.1 Стимулы и сигнальная передача программы апоптоза
Внеклеточные сигналы, отвечающие за инициацию апоптоза в различных клетках могут быть физиологическими или патологическими. Например, при нормальном развитии и функционировании ткани, подавление ростовых факторов, гарантирующих выживание, или присутствие «лигандов клеточной гибели» являются механизмами избавления организма от ненужных и поврежденных клеток путем апоптоза. Однако множество внешних импульсов, таких как химиотерапия, радиация, повышенное окисление, токсины вызывают повреждение ткани также путем неадекватной активации апоптоза. Таким образом, существует множество сигналов и сигнальных путей активации апоптоза, они различны для разных клеточных типов или для одного типа, но разной стадии жизненного цикла клеток [Golstein P. 1997; Gong В. 1999; Hardwick J.M. 1997; Haunstetter A. 1998; Havrilesky L.J. 1996; Hay S. 2002].
1.4.1.1 Рецепторы и лиганды клеточной гибели
«Рецепторы клеточной гибели», расположенные на поверхности клетки, представляют собой подсемейство в составе 26-членного семейства рецепторов TNF (фактора некроза опухоли), для активации апоптоза неоходим цитоплазматический домен [Барышников В.В. 2002; Hengarten O.M. 2000; Hardwick J.M. 1997; Haunstetter A. 1998].
Это семейство у млекопитающих включает рецептор-1 TNF-альфа (TNFRI), р75-нейротрофин-рецептор (p75 NTR), Fas, рецептор TNF-альфа-связанного апоптоз-индуцирующего лиганда (DR4), рецепторы клеточной гибели-3 (DR3), - 5(DR5), -6 (DR6) [Banner D.W. 1993; Bardelli A. 1996; Bodmer J. 2000; Fadok V.A. 2001; Faubion W.A. 1999; Galle P.R. 1995; Griffith T.S. 2000]. В большинстве случаев активация рецепторов клеточной гибели с помощью их лигандов вызывает тримеризацию рецептора и образование сигнального комплекса, индуцирующего апоптоз (DISC) на цитоплазматической поверхности клеточной мембраны. Затем домены тримеризованного рецептора координируют взаимодействие ассоциированный, цитоплазматического участка каждого рецептора с адаптером FADD (Fas-содержащий домен клеточной гибели протеин). Fas часто вовлекает зимогенную форму проапоптотической цистеин-протеазы – каспазы-8, для дополнения DISC. Автопроцессинг прокаспазы-8 в ее активную форму приводит к быстрому инициированию клеточной гибели [Guo Y. 2002; Kirsch D.G. 2001; Liang Y. 2002; Zhang H. 2000].
Рисунок 2 - Рецепторный путь апоптоза.
Fas - член семейства рецепторов TNF, которые относятся к ТМ белкам I типа. Представители данного семейства характеризуются наличием последовательностей обогащенных от двух до пяти остатками цистеина во внеклеточной области, которые взаимодействуют с тримерньши лигандамн-индукторами. Fas и некоторые члены данного семейства в цитоплазматической области содержит DD, необходимый для взаимодействия с адапторными молекулами и обязательный для индукции апоптоза [Siegel R.M. 2000; Tokano Y. 1996; Zhu N. 1997]. В норме Fas экспрессируется клетками нелимфоидного происхождения, такими как сердце, легкие, почки, кожа, яичники, печень, желудок, кишка и др. Также описаны функциональные растворимые формы Fas-рецептора (sFas), которые образуются при альтернативном сплайсинге. sFas конкурирует с мембранно-связанным Fas-рецептором (Fas) за взаимодействие с лигандом и может ингибировать Fas-опосредованный апоптоз in vitro [Siegel R.M. 2000]. FasL относится к многочисленному семейству гомотримерных лигандов TNF. Подобно большинству членов семейства, FasL синтезируется в виде ТМ молекулы (FasL); растворимый тример FasL (sFasL) образуется при расщеплении металлопротеиназой, Посттрансляционные модификации FasL (частичный протеолиз) оказывают сильное влияние на его активность, потому что только мембранно-связанный или мультимеризованный FasL стимулирует ПКГ, a sFasL ингибирует апоптоз, конкурируя с FasL за взаимодействие с Fas-рецептором [Барышников В.В. 2002]. FasL экспрессируется активированными Т- и В-лимфоцитами, КК.-клетками, нейтрофилами. Кроме того, значительные уровни экспрессии мРНК FasL обнаружены в нелимфоидных тканях: иммуннопривелигерованиых (яички, матка и яичники) и тканях, которые приспособлены к частому проникновению лимфоцитов (тонкая и толстая кишка, легкое и печень) [Tokano Y. 1996; Zhu N. 199]. Взаимодействие FasL с Fas приводит к образованию кластеров рецепторных молекул и связыванию их внутриклеточных участков с адаптерными молекулами, FADD. Через адаптер к комплексу лиганд/рецептор присоединяются эффекторы - молекулы неактивных предшественников инициирующих каспаз - прокаспазы-8, что опосредуется при взаимодействии DED доменов FADD и прокаспазы-8 (рис.2) [Socie G. 2004; Vaux D.L. 1996]. В результате формируется молекулярный комплекс, DISC, в котором происходит активация каспаз [Werner A.B. 2002; Zhang H. 2000].
Образование DISC, инициирующего процесс апоптоза, происходит по двум механизмам. В клетках 1 типа генерируется достаточный уровень активированной каспазы-8, что позволяет активировать другие прокаспазные ферменты, функционирующие как конечные эффекторы апоптоза. В клетках 2
типа апоптоз, инициированный низким уровнем каспазы-8, активированной комплексом DISC, усиливается за счет дестабилизации митохондрий, с участием каспаза-8 – опосредованной активацией проапоптотического Bid-протеина. Тримеризованные рецепторы клеточной гибели подвергаются олигомеризации и располагаются на одном полюсе клеточной поверхности. Этот процесс, «образование шапки», возможно опосредуется церамидом, и облегчает аутокатализ прокаспазы-8 [Werner A.B. 2002]. Многие лиганды рецепторов гибели оказывают множественное действие, независимое от апоптоза. Каким образом один лиганд – TNF-альфа – оказывает такой широкий спектр действий, включающий пролиферацию, апоптоз, активацию иммунных клеток, воспаление? Одним объяснением является взаимодействие специфических белков на или рядом с цитоплазматическими доменами рецепторов гибели, которое вызывает разное биологическое действие лиганд-активированного рецептора [Sun X.-M. 2002; Werner A.B. 2002; Zhang H. 2000].
Рисунок 3 - Рецепторзависимые пути апоптоза.
Например, адаптерный белок TRAF2 (для TNF-альфа- рецептор-ассоциированного фактора 2) вызывает сигнальную трансдукцию TNFRI, активируя либо проапоптотический (JNK), либо антипапоптотический (NFkB) пути. Сфингозин-киназа взаимодействует с TRAF-2 в клетках HEK 293T, активируя NFkB, но не JNK. Наличие или отсутствие этого фермента влияет на ответ клетки на TNF-альфа. Конечно сигнальный путь, активируемый TNF-альфа, подвержен влиянию большого количества других сигнальных механизмов, активируемых различными факторами[Owen-Shaub L. 1994; Siegel R.M. 2000].
|
