РАЗДЕЛ 1.2. Редокс-регуляция клеточной пролиферации
Для того чтобы понять, механизм редокс-регуляции пролиферации, необходимо вспомнить - что такое пролиферация. Пролиферация - это процесс увеличения количества клеток, определяющийся соотношением скоростей деления клеток и их гибели. Гибель клеток может происходить как в результате повреждения целостности клетки (некроз), так и путем активации внутриклеточных программ (апоптоз). Деление клетки строго регулируется как внутренними программами, так и внешними факторами (факторы роста, цитокины и др.), воздействующими на внутренние программы. Каждому делению предшествует комплекс последовательных внутриклеточных изменений, т.н. клеточный цикл, основная цель которого – удвоение содержимого клетки и его равномерное распределение между двумя дочерними клетками при делении.
1.2.1. Клеточный цикл и его регуляция
Клеточный цикл представляет собой высокоорганизованную и строго регулируемую последовательность переходов от G1 фазы к S, к G2 и митозу (М). Переход от одной фазы к другой регулируется последовательной экспрессией белков циклинов и активацией циклин-зависимых киназ (cyclin dependent kinase, CDK). CDK представляют собой серин/треоининовые протеинкиназы, которые активируются при соединении с циклинами и запускают события клеточного цикла, путем фосфорилирования соответствующих остатков в белках-мишенях [79]. На Рис. 1.1. представлены основные циклин/CDK комплексы позвоночных, специфичные для той или иной фазы клеточного цикла. Уровень циклинов меняется по мере прогрессии клеточного цикла, приводя к колебаниям активности CDK (См. Рис. 1.1). Помимо циклинов активность CDK комплексов регулируется с помощью CDK-активирующей киназы (CDK-activating kinase, CAK), ингибиторов CDK (cyclin-dependent kinase inhibitor protein, CKI), а также протеолитическими процессами (убиквитинирование) [80, 81].
Для полной активации комплекса циклин/CDK необходимо фосфорилирование CDK по Thr161 (CDK1), Thr160 (CDK2) или Thr172/177 (CDK4/6), которое осуществляется в ядре с помощью CAK [83-85]. САК состоит из трех субъединиц: CDK7, циклин H и белка Mat1, который активирует комплекс циклин H/CDK7. Связывание с циклином приводит к конформационным изменениям в CDK, которые делают возможным фосфорилирование CDK с помощью CAK [86]. Активность CAK-киназы постоянна на протяжении всего клеточного цикла [87].
Рисунок 1.1. Основные фазо-специфические комплексы циклинов с циклин-зависимыми киназами у позвоночных. Из [82], с изменениями. См. пояснения в тексте.
На сегодняшний день насчитывается два семейства CKI: INK4 и Cip/Kip. Семейство INK4 включает белки р15, р16, р18 и р19, которые специфически связываются с CDK4/6, препятствуя образованию комплекса с циклином D [88, 89]. Увеличение уровня белка р16 часто наблюдается в стареющих клетках и сопровождается снижением пролиферативных способностей [90]. Белки р21, р27 и р57, относящиеся к Cip/Kip семейству, связываются с CDK2 и контролируют прогрессию через S фазу [91]. Ингибирование CKI часто приводит к нарушению контроля пролиферации и опухолевой трансформации [92-94].
Важную роль в регуляции протеолитических процессов во время клеточного цикла играет Комплекс стимулирующий анафазу (Anaphase promoting complex, АРС), который представляет собой убиквитин-лигазу, фермент катализирующий реакцию присоединения множественных копий белка убиквитина к боковым цепям лизина в молекуле белка-мишени [95, 96]. Полиубиквитинированние часто является сигналом к деградации белка, которое происходит в 26S протеасоме [97]. АРС присутствует в клетке на протяжении всего цикла, однако активность комплекса варьирует. АРС активируется в середине митоза, а ингибирование АРС происходит в конце G1 фазы [98, 99].
Некоторые химические соединения, ионизирующее и УФ излучение, ингибиторы репликации ДНК, а также ошибки при репликации или репарации ДНК приводят к нарушению структуры ДНК и остановке клеточного цикла. Главную роль в этом процессе играют 2 серин/треониновые протеин киназы – АТМ (ataxia telangiectasia mutated) и ATR (ATM-Rad3-related protein). АТМ активируется в ответ на появление двуцепочечных разрывов ДНК, образующиеся под воздействием ионизирующего облучения. ATR активирует под действием УФ-облучения или при нарушениях репликации ДНК. ATM и ATR прикрепляются к сайту повреждения ДНК и фосфорилируют различные белки, в том числе Chk1 и Chk2, которые приводят к остановке клеточного цикла в G1 фазе, препятствуя удвоению ДНК, или в G2 фазе, блокируя вход в митоз [100-103].
Инициация пролиферации. Сигнальные молекулы, стимулирующие деление клетки, называются митогенами. К наиболее распространенным митогенам относятся факторы роста (ФР; эпидермальный ФР (EGF), ФР фибробластов (FGF), ФР тромбоцитов (PDGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF) и др.). Факторы роста связываются со специфическими рецепторами на поверхности клетки, приводя к их активации. Активированные рецепторы индуцируют внутриклеточные сигнальные каскады митоген-активируемых протеинкиназ (mitogen-activated protein kinases, МАРК). Существует 4 вида МАРК: ERK1/2, JNK, p38 и ERK5. Каскад ERK1/2 активируется в ответ на пролиферативные стимулы, например взаимодействие ФР с рецептором на поверхности мембраны. Каскады JNK, p38 и ERK5 активируются в основном при стрессе. ERK1/2 представляют собой консервативные серин/треониновые протеинкиназы, способные фосфорилировать различные белки-мишени в цитопламе, мембранах и ядре, и, таким образом, регулировать большое разнообразие внутриклеточных процессов [104, 105]. Показано, что активация ERK1/2 необходима для пролиферации клеток. Активированные ERK1/2 киназы принимают участие в синтезе пиримидинов, ремоделировании хроматина, синтезе новых рибосом, активации факторов трансляции и транскрипции, а также в регуляции G1/S и G2/M переходов между фазами клеточного цикла. Ингибирование ERK1/2 приводило к остановке пролиферации и накоплению клеток в одной из фаз клеточного цикла. Финальным шагом ERK1/2 киназ является активация факторов транскрипции (Myc, Elk-1, Sap-1, TIF-IA, и др.), которые индуцируют экспрессию генов, запускающих события клеточного цикла [106-109].
G1 фаза. В G1 фазе происходит активный рост новообразованной дочерней клетки, проверяется целостность и равномерность распределения хромосом после митоза. Первым под действием митотического сигнала активируется экспрессия циклинов D (в частности D1), которые образуют комплексы с CDK 4 или CDK 6 [110]. Главная роль комплекса циклин D1/CDK4/6 заключается в фосфорилировании белка ретинобластомы (retinoblastoma tumor suppressor protein, рRb) и активация фактора транскрипции E2F. В отсутствии митотической стимуляции E2F связан с pRb и поэтому не активен. Фосфорилирование pRb приводит к конформационным изменениям в молекуле pRb и освобождению E2F [111]. E2F связывается со специфической последовательностью ДНК и активирует экспрессию большого количества разнообразных генов необходимых для входа в S фазу, среди них циклины Е и А, ДНК полимераза, белок-ингибитор раннего митоза (early mitotic inhibitor, Emi1) и др. [112]. В конце G1 фазы циклин D1 разрушается, что приводит к ингибированию связанных с ним CDK. Разрушение циклина D1 происходит с помощью киназы гликогенсинтетазы (GSK-3β), которая фосфорилирует циклин D1 по Thr286, или с помощью Mirk/dyrk киназы, которая фосфорилирует циклин D1 по Thr288. В обоих случаях фосфорилирование влечет за собой деградацию циклина в протеасомах [113, 114]. Ингибирование экспрессии циклина D1 препятствует переходу клеток в S фазу. В то время как эктопическая экспрессия циклина D1 ускоряет прогрессию через G1 фазу [115].
Интересно отметить, что для перехода из G1 фазы в S, также необходима активация ERK1/2 с последующей транслокацией протеинкиназы в ядро. Показано, что ERK1/2 индуцирует экспрессию циклина D1, предположительно, через активацию экспрессии генов семейства Fos и Myc. Экспрессия Fos запускается с помощью ERK-активируемого фактора транскрипции Elk. Фосфорилирование Myc по Ser62 с помощью ERK1/2 увеличивает стабильность Myc, который способен напрямую индуцировать экспрессию циклина D1 [106].
В конце G1 фазы находится т.н. точка «Старт» (Start или Restriction point) - контрольная точка, в которой оценивается готовность клетки и благоприятность внешних условий (наличие питательных веществ, факторов роста и др.) к переходу в S фазу и удвоению ДНК. Прошедшая через «Старт» клетка – запрограммирована на репликацию и больше не зависима от внешних стимулов.
К концу G1 фазы возрастает количество циклина Е, который образует комплекс с CDK2. Фосфатаза Cdc25A дефосфорилирует CDK2 по p-Tyr15 и p-Thr14, активируя комплекс циклин Е/CDK2, необходимый для продвижения клетки из G1 в S [116]. Как только клетки входят в S фазу циклин Е деградирует и CDK2 соединяется с циклином А [81, 110]. Циклин А не накапливается в клетке вплоть до поздней G1 фазы из-за убиквитинирования под действием АРС. Циклины D и Е нечувствительны к действию АРС. Перед входом в S фазу Emi1, экспрессия которого запускается с помощью E2F, ингибирует АРС, способствуя стабилизации циклина А и активации СDK2. [117].
S фаза. Основным событием S фазы является удвоение ДНК (репликация) и хроматина. Репликация может начинаться только в определенных местах – точках начала репликации (origins of replication, OR), которые разбросаны по всей ДНК. Подготовка к репликации начинает еще в конце митоза – начале G1 фазы, когда в точках начала репликации собираются т.н. пререпликационные комплексы (pre-RC), состоящие из большого количества белков необходимых для инициации репликации. Эта стадия часто называется лицензированием (licensing) точек начала репликации, т.к. синтез ДНК может происходить только в OR содержащих pre-RC. В S фазе активный комплекс циклин А/CDK2 запускает сборку преинициирующих комплексов вокруг компонентов pre-RC. Преинициирующие комплексы раскручивают спираль ДНК подготавливая место посадки ДНК, полимеразы и других ферментов репликации. Сразу после репликации OR комплекс pre-RC разбирается под действием циклин А/CDK2. Сборка новых pre-RC в S фазе невозможна из-за присутствия активных СDK, что препятствует множественной репликации [118, 119]. Репликация хромосом состоит из репликации ДНК и репликации хроматина. Основную массу хроматина составляют белки гистоны. Циклин А/CDK2 индуцирует синтез гистонов, поставляя материал для упаковки новосинтезированной ДНК. К концу S фазы каждая хромосома состоит из двух пар идентичных сестринских хроматид. Каждая пара сестринских хроматид связана между собой комплексами белков, когезинами, которые регулируют процесс разделения сестринских хроматид при митозе [120].
G2 фаза. Прохождение клетки через G2 фазу и вход в митоз регулируется комплексом циклина В/CDK1 [121]. На сегодняшний день семейство циклинов В состоит из 5 белков – циклины В1, В2, В3, В4 и В5, из которых В1 является наиболее охарактеризованным [122]. Промотор циклина В1 содержит сайты связывания для множества транскрипционных факторов, в том числе B-Myb, NF-Y, USF, p53, p21, Ap-1, Ap-2, Ets-1 и др. [123]. Экспрессия гена циклина В1 наблюдается на протяжении всего клеточного цикла, однако в G2 уровень циклина В1 в 50 раз больше, чем в G1. Наивысшего уровня циклин В1 достигает в конце G2 фазы – начале митоза [124]. В середине митоза уровень циклина В1 резко снижается за счет работы АРС и остается низким до поздней S фазы, когда происходит ингибирование АРС с помощью Emi1 и комплекса циклин А/CDK2 [117, 125]. Усиление экспрессии циклина В1 приводит к его накоплению в цитоплазме, достигнув определенной концентрации циклин В связывается с CDK1. Образовавшийся комплекс циклин В1/CDK1 перемещается в ядро [126]. Транслокация циклин В1/CDK1 в ядро возможна только при фосфорилировании 5 серинов в сайте удерживающем циклин В1 в цитоплазме (cytoplasmic retention site, CRS): Ser116, Ser26, Ser128, Ser133 и Ser147 [126]. Показано, что ингибирование ERK1/2 препятствует фосфорилированию CRS, что приводит к удерживанию комплекса циклин В1/CDK1 в цитозоле [127]. Yang et al. предполагают, что CRS циклина В1 является частью последовательности для экспорта белка в ядро (nuclear export sequences, NES), с помощью которой циклин В1 взаимодействует с экспортирующим ядерным рецептором (chromosome region maintenance 1, CRM1) [128]. Однако комплекс остается неактивным, потому что протеинкиназы Wee1 и Myt1 фосфорилируют CDK1 по Thr14 и Tyr15, ингибируя активность CDK1. Wee1 находится в ядре, а Myt1 – на цитоплазматической стороне мембраны эндоплазматического ретикулума [129-131]. Интересно отметить, что активация ERK1/2 снижает активность Myt1 через активацию RSK, непосредственного субстрата ERK1/2, который фосфорилирует и ингибирует Myt1, приводя к остановке клеточного цикла в G2/M [132]. Для активации комплекса циклин В/CDK1 необходима фосфатаза Cdc25С, которая дефосфорилирует CDK1, убирая ингибирующие фосфаты [133, 134]. Активированный циклин В/CDK1 запускает события раннего митоза [129]. Параллельно с активацией циклин В/CDK1 происходит ингибирование Wee1 и Myt1. В течение интерфазы Cdc25C-associated protein kinase (C-TAK1) фосфорилируют Cdc25С по Ser216, что способствует его связыванию с белком 14-3-3 [135-137], который удерживает Cdc25С в цитоплазме, препятствуя перемещению фосфатазы в ядро и активации циклин В/CDK1 [138, 139]. Активирующаяся в ответ на повреждение ДНК Chk1 киназа тоже способна фосфорилировать Cdc25С, приводя к ингибированию фосфатазы и остановке прогрессии клеточного цикла [138, 140, 141].
Митоз. Основная задача митоза – равномерное распределение содержимого материнской клетки между двумя дочерними. Митоз состоит из нескольких подфаз (профаза, прометафаза, метафаза, анафаза, телофаза) и заканчивается цитокинезом, делением клетки надвое. События раннего митоза (профаза, прометафаза, метафаза) запускаются активированным во время G2 фазы комплексом циклин В/CDK1. Циклин В/CDK1 фосфорилирует субъединицы белка конденсина, это стимулирует свертывающую активность конденсина и инициирует конденсацию хромосом. Параллельно активируется сборка митотического веретена деления. Фосфорилирование белков, входящих в состав комплексов ядерных пор и ламины, приводит к разрушению ядерной оболочки. В конце метафазы циклин В/CDK1 активирует АРС. Клетки не входят в анафазу (не происходит разделения хроматид) до тех пор, пока все хромосомы не прикрепятся к веретену деления. Неприкрепленные хроматиды блокируют разделение хроматид. Это происходит, вероятно, за счет того, что неприкрепленные кинетохоры посылают сигнал АРС, блокирующий его активность [142]. Активность АРС регулируется с помощью двух дополнительных белков Cdc20 и Cdh1, которые выполняют функцию субстрат-специфических связывающих доменов. Циклин В/CDK1 фосфорилирует АРС, приводя к образованию комплекса АРС/Cdc20 и усилению активности АРС. АРС/Cdc20 ингибирует АРС/Cdh1 за счет фосфорилирования Cdh1. АРС/Cdc20 убиквитинирует белок секурин, что ведет к его деградации и активации протеолитического фермента, сепаразы, разрушающей комплексы когезинов, инициируя разделение хромосом и их расхождение к полюсам деления. Помимо участия в расхождении хромосом, АРС инициирует деградацию всех циклинов, приводя к инактивации всех CDK и дефосфорилированию их мишеней. Эти изменения необходимы для завершения митоза – разрушения веретена деления и цитокинеза. Деградация циклина В приводит к инактивации комплекса циклин В/CDK1, а, следовательно, и стимула активирующего АРС/Cdc20. Снижение АРС/Cdc20 в конце митоза способствует увеличению активности АРС/Cdh1. АРС/Cdh1 также как и АРС/Cdc20 убиквитинирует циклины приводя к их деградации [98]. В результате период времени от анафазы до поздней G1 является периодом инактивации CDK. Этот период необходим, так как сдерживает какое то время клетку от вступления в новый клеточный цикл. Некоторые клетки никогда не входят в клеточный цикл оставаясь в т.н. фазе покоя - G0, экспрессия генов циклинов и CDK в них подавлена [80].
Подводя итог вышесказанному, важно отметить следующее: пролиферация представляет собой последовательность переходов от G1 фазы клеточного цикла к S, G2 и митозу. События каждой фазы запускаются путем фосфорилирования определенных белков с помощью циклин-зависимых киназ. Активность циклин-зависимых киназ регулируется с помощью синтеза/деградации их функциональных субъединиц, циклинов, а также фосфорилирования/дефосфорилирования самих киназ. На сегодняшний день в литературе накоплено множество данных о взаимосвязи между состоянием редокс-статуса клетки и функционированием некоторых белков-регуляторов клеточного цикла, что позволяет предположить существование редокс-регуляции клеточного цикла.
1.2.2. Редокс-регуляция клеточного цикла
Впервые существование редокс-регуляции клеточного цикла было упомянуто в работе Rapkine. Он наблюдал колебания уровня растворимых в трихлоруксусной кислоте тиолов по мере прогрессии клеточного цикла. Концентрация тиолов падала в течение подготовки к делению и возрастала по мере формирования митотического аппарата [143]. Позже Kawamura наблюдал усиление окраски тиоловых групп (-SH) белков по мере сборки веретена деления в яйцах морского ежа находящихся в профазе. Окрашивание оставалось интенсивным в метафазе, постепенно снижалось по мере продвижения клеток по анафазе и было почти незаметным в телофазе [144]. Mauro et al., используя синхронизированные клетки HeLa, наблюдали снижение концентрации несвязанных с белками -SH групп в G1 фазе с последующим увеличением концентрации к концу S фазы. Концентрация восстановленных тиоловых групп в составе белков, наоборот, была максимальной в G1 и постепенно снижалась по мере прогрессии через S фазу [145]. Tu et al. продемонстрировали взаимосвязь между экспрессией генов и интенсивностью дыхательных процессов. Экспрессия генов, кодирующих рибосомальные белки, факторы инициации трансляции и других регуляторов синтеза белка, происходила во время фазы активного дыхания, что, возможно, связано с потреблением большого количества энергии во время синтеза белка. Репликация ДНК и прогрессия клеточного цикла, наоборот, происходили в условиях пониженной дыхательной активности, что, вероятно, способствовало снижению окислительного повреждения ДНК под действием АФК, образующихся в большом количестве в процессе дыхания [146]. Существование взаимосвязи между редокс-статусом и синтезом белка было подтверждено в работе Jonas et al. При исследовании синтеза ДНК по интенсивности включения синтетического аналога тимина - 5-бром-2-дезоксиуридина (БДУ) было обнаружено, что при окисленном состоянии редокс-статуса скорость синтеза ДНК минимальна и значительно возрастает при смещении редокс-статуса в более восстановленное состояние [147].
Рисунок 1.2. Изменения активности MnСОД и уровня АФК по мере прогрессии клеточного цикла. 
Проведенные в нескольких независимых лабораториях исследования выявили, что по мере прогрессии клеточного цикла от G0/G1 к митозу происходит увеличение уровня АФК. Концентрация АФК, измеренная по флуоресценции редокс-чувствительного красителя DCFH2-DA, была максимальна в поздней S фазе, а также в G2+M по сравнению с G1 [26]. Параллельно с повышением АФК, увеличивался уровень основного редокс-буфера клетки – глутатиона (GSH) [148] – и достигал максимума в G2 и M фазах по сравнению с G1, что, вероятно, являлось ответной реакцией на рост АФК [47, 149]. Интересно отметить, что активность основного антиоксидантного фермента клетки - MnСОД – была максимальна в G1 фазе и постепенно снижалась по мере прогрессии через S и G2 фазы что, возможно, и являлось причиной роста АФК (см. Рис. 1.3) [27, 148, 150]. Более детальное исследование изменения уровня О2•- и Н2О2 по мере прогрессии клеточного цикла выявило, что О2•- повышен в G1 фазе, а уровень Н2О2 увеличивается в G2. Поскольку MnСОД играет важную роль в регуляции соотношение между О2•- и Н2О2, то было сделано предположение, что MnСОД выполняет роль переключателя пролиферативных процессов. Повышение активности MnСОД приводило к снижению уровня О2•-, увеличению уровня Н2О2 и усилению пролиферации. Снижение активности MnСОД сопровождалось ростом уровня О2•-, понижением уровня Н2О2 и замедлением пролиферации [27, 151]. Изменения внутриклеточного редокс-статуса при прогрессии клеточного цикла позволяют предположить существование т.н. редокс-цикла внутри клеточного цикла и тесно с ним взаимосвязанного. Причем, смещение редокс-статуса в более окисленное состояние сопровождается активацией пролиферации, а смещение редокс в более восстановленное состояние приводит к замедлению пролиферации [25, 152].
Молекулярные механизмы редокс-регуляции. С помощью комбинированного in vitro/биоинформатического анализа выявлено, что 92 из 1634 исследованных белков-регуляторов клеточного цикла содержат в своей структуре участки, способные модифицироваться в ответ на изменения редокс-статуса клетки. К редокс-чувствительным группам были отнесены тиольные группы цистеина и метионина (–SH), дисульфидные связи (-S-S-), ионы переходных металлов (Fe2+, Zn2+, Cu2+ и др), сопряженные системы связей в белках-переносчиках электронов дыхательной цепи (Рис. 1.3). Окисление тиоловых групп с образованием дисульфидных связей под действием Н2О2 часто сопряжено с внутримолекулярными конформационными изменениями, приводящими к активации/инактивации молекулы (Рис. 1.3. А, Б). Изменение степени окисления металлов-кофакторов киназ и фосфатаз под действием О2-• часто приводит к ослаблению связей, удерживающих металл в комплексе с белком, диссоциации металла из комплекса и нарушению редокс-регуляции (Рис. 1.3. В, Г) [29, 149].
Показано, что взаимодействие некоторых митогенов (EGF, PDGF и др.) с их рецепторами на поверхности мембран сопровождается образованием небольшого количества Н2О2 [153, 154]. Добавление Н2О2 в отсутствии EGF или PDGF индуцировало внутриклеточный сигнал сходный с сигналом факторов роста. Каталаза и пероксиредоксин ингибировали Н2О2–индуцированный сигналинг [154-156]. Показано, что присутствие Н2О2 необходимо для фосфорилирования и активации МАР-киназы ERK1/2 [155, 157]. Интересно отметить, что молекула малой ГТФазы Ras, активатора ERK1/2, содержит редокс-чувствительные цистеины [158]. Модификации цистеинов в молекуле Ras под действием Н2О2 может быть одним из механизмов редокс-регуляции ERK1/2 [159]. Ингибирование образования Н2О2 с помощью NAC или GSH, а также усиление экспрессии MnСОД препятствовало активации ERK1/2 и дальнейшей передачи сигнала от рецепторов факторов роста к ядру [28, 160].
Рисунок 1.3. Примеры редокс-регулируемых модификаций в молекулах белков. Из [149] с изменениями. (А) Обратимое глутатионилирование остатка цистеина. (Б) Образование дисульфидной связи в молекуле тиоредоксина. (В) Взаимодействие электрона с изоаллоксазиновой сопряжённой циклической системой флавина – кофактора белка электронно-транспортной цепи. (Г) Окисленная иона железа в составе гемма. (Д) Диссоциация окисленного переходного металла (Х) из металлсвязывающего домена белка.
В нескольких независимых лабораториях было показано, что ДНК-связывающий домен некоторых факторов транксрипции (р53, NF-kB, AP-1, c-Myb, Ets, Sp-1, Egr-1 и др.) содержит консервативные цистеины, замещение или удаление которых приводит к нарушению редокс-регуляции и изменению активности/функции белка (см. [161] и ссылки в нем). Например, замещение консервативных цистеинов в молекуле опухолевого супрессора р53 приводит к снижению его ДНК-связывающих способностей. Неспособный связываться с ДНК белок не может выполнять свои функции фактора транскрипции и опухолевого супрессора, что часто приводит к трансформации клетки и чрезмерной пролиферации [162, 163]. Сходным образом замещение цистеинов в молекулах NF-kB и АР-1 и нарушение их редокс-регуляции способствует абберантной пролиферации и развитию опухолей [164, 165].
Показано, что промотор циклина D1, важного регулятора прогрессии клетки через G1 фазу, содержит сайты связывания редок-регулируемых факторов транскрипции, таких как NF-kB, AP-1, Sp-1 и др, то есть экспрессия циклина D1 зависит от состояния внутриклеточного редокс-статуса [166]. В условиях окислительного стресса происходит глутатионилирование c-Jun, одной из субъединиц АР-1, по Cys269, который находится в сайте связывания ДНК. Глутатионилирование ДНК-связывающего домена ингибирует активность АР-1 и репрессирует экспрессию циклина D1. В опухолевых клетках часто происходит мутация Cys269 и его замена на серин, что приводит к потере редокс-регуляции и абберантной пролиферации [167]. Чувствительность к состоянию редокс-статуса была также показана для c-Myb и NF-Y, регулирующим транскрипцию циклинов В1 и А. Фактор транскрипции b-Myb содержит семь редокс-чувствительных цистеинов. Смещение окислительно-восстановительного равновесия в более окисленное состояние с помощью окислителя диамида значительно снижало активность b-Myb, приводя к нарушению связывания транскрипционного фактора с ДНК. Интересно отметить, что повышенный уровень b-Myb часто встречается в опухолевых клетках. Как отмечалось выше, большинство опухолевых клеток характеризуется повышенным содержанием АФК, что возможно и приводит к нарушению регуляции пролиферации с помощью b-myb [168]. Фактор транскрипции NF-Y на 30% существует в виде неактивных димеров. Добавление восстановителя, дитиотреитола, к NF-Y способствовало усилению связывания NF-Y с ДНК. Замещение Cys85 и Cys89 в молекуле NF-Y на серины приводило к тому, что NF-Y присутствовал только в форме мономеров и его активность не зависела от дитиотреитола [169].
Рисунок 1.3. Редокс-регуляция клеточного цикла. Из [152] с изменениями, см. пояснения в тексте.
Повышение уровня GSH при обработке мышиных фибробластов, находящихся в ранней G1 фазе, с помощью NAC приводило к нарушению прогрессии клеточного цикла, увеличению количества клеток в G1 фазе и снижению количества клеток в S фазе. Нарушению прогрессии клеточного цикла предшествовало уменьшение уровня циклина D1, увеличение уровня р27, ингибитора Cdk4/6, и дефосфорилирование рRb, что указывало на зависимость уровня циклина D1, р27 и рRb от состояния редокс-статуса. После удаления NAC из среды наблюдали кратковременный скачок прооксидантного уровня (Н2О2) и возобновление прогрессии клеточного цикла [170]. Полученные данные указывали на необходимость присутствия небольших количеств Н2О2 для перехода клеток из G1 в S фазу клеточного цикла.
Подобно действию NAC, усиление экспрессии каталазы или GPx, катализаторов разложения Н2О2, приводило к снижению внутриклеточного уровня Н2О2 и остановке клеточного цикла в G1 фазе [63, 171, 172]. Обработка Her1 фибробластов с помощью Н2О2, наоборот, повышала уровень циклина D1, что предположительно было результатом ингибирования деградации циклина D1 [173]. Несмотря на то, что повышенный уровень GSH ингибировал прогрессию клеточного цикла, полное удаление тиолов из среды также препятствовало переходу клеток в S фазу. Удаление тиолов из среды культивирования лимфоцитов, препятствовало экспрессии и фосфорилированию рRb под действием IL-2. Добавление GSH, NAC и 2-меркаптоэтанола обращало этот эффект [174]. Из полученных данных можно сделать вывод о том, что хотя небольшое увеличение уровня АФК необходимо для активации рRb, чрезмерное повышение прооксидантного уровня приводит к нарушению клеточного цикла.
Дальнейшее исследование роли GSH и АФК в регуляции клеточного цикла выявило, что снижению экспрессии циклина D1 в клетках, обработанных NAC, предшествовало повышение уровня О2•-. Инкубация клеток с Tiron, ловушкой для О2•-, препятствовало нарушению прогрессии клеточного цикла под действием NAC, указывая на то, что О2•- может оказывать ингибирующее действие на экспрессию циклина D1 [175]. Однако, снижение уровня О2•- с помощью темпола, препятствовало накоплению циклина А, регулятора G1/S перехода, и прогрессии через S фазу, приводя к остановке клеточного цикла в поздней G1 фазе. Удаление темпола из среды способствовало восстановлению прогрессии клеточного цикла. Эти данные указывают на необходимость присутствия О2•- для перехода клетки из G1 в S фазу. Повышенная экспрессия Emi1, ингибитора комплекса APC/Cdh1, отменяла эффект темпола. Клетки экспрессирующие Emi1, демонстрировали уровень циклина А сравнимый с контролем и отсутствие блока в G1 фазе. К сходным результатам приводило применение ингибиторов 26S протеасомы. Как было отмечено выше убиквитинирование циклина А с помощью комплекса APC/Cdh1 в течение G1 фазы препятствует переходу в S фазу. Исходя из имеющихся данных можно предположить, что О2•- играет важную роль в ингибировании APC/Cdh1 и поэтому его присутствие необходимо для перехода в S фазу. Таким образом, было показано, что повышение уровня АФК при прогрессии из G1 в S необходимо для ингибирования деградации циклина А под действием АРС [176]. Отсюда следует, что присутствие О2•- в начале G1 фазы ингибирует экспрессию циклина D1 и приводит к остановке клеточного цикла. Однако в конце G1 фазы, О2•- необходим для прогрессии из G1 в S. Кажущаяся несогласованность является лишь еще одним доказательством существования редокс-цикла внутри клеточного цикла, а также подчеркивает сложность и важность редокс-модификаций для регуляции пролиферации.
Еще один фермент S фазы, топоизомераза II, играет важную роль в поддержании целостности ДНК, путем распутывания переплетенных в процессе репликации сестринских хроматид и способствуя релаксации ДНК. Goswami et al показали, что уровень мРНК топоизомеразы варьирует в зависимости от фазы клеточного цикла достигая максимума в S фазе. Дальнейшие исследования выявили, что экспрессия топоизомеразы II регулируется за счет взаимодействия 3`-UTR последовательности мРНК с редокс-чувствительными белками [32, 57].
Фосфатаза Cdc25С, важный регулятор прогрессии клеточного цикла через G2 фазу, содержит в активном центре цистеин (Cys377) и поэтому чувствителен к изменениям редокс-статуса. Образование связи между Cys377 и Cys330 приводит к усилению связывания Cdc25С с белком 14-3-3, что препятствует перемещению Cdc25С в ядро и активации комплекса циклин В1/Cdk1 (см. Рис. 1.4) [138, 177]. В независимом исследовании было показано, что обработка клеток Н2О2 приводит к инактивации Cdc25C, в то время как белок мутантный по Cys377 и Cys330 был нечувствителен к действию Н2О2. [177, 178]. Как было отмечено выше, уровень GSH возрастает по мере приближения к митозу [148], это вероятно способствует переходу Cdc25C в более стабильное состояние и активации циклин В/Cdk1.
Рисунок 1.4. Редокс-регуляция активности Cdc25C фосфатазы. Из [177] c изменениями. См. пояснения в тескте.
Chang et al. показали, что в G2 фазе активная CDK1 фосфорилирует пероксиредоксин I , внутриклеточный фермент катализирующий деградацию Н2О2, ингибируя его активность. Накопление Н2О2, в результате снижения активности пероксиредоксина I, представляется необходимым для прогрессии через G2 фазу в М [179]. Как было отмечено выше, активность MnСОД снижается по мере прогрессии клеточного цикла от G1 к М фазе, способствуя повышению уровня АФК. Повышение экспрессии MnСОД в клетках карцином усиливало формирование индуцированного радиацией G2 блока, указывая на то, что высокий уровень MnСОД препятствует прогрессии клеток через G2 фазу [180]. Другой внутриклеточный антиоксидант, витамин С, также был способен индуцировать G2 блок в клетках карциномы HeLa и глиобластомы T98G человека. Индукция G2 блока под действием витамина С сопровождалась усилением экспрессии циклина В1 и снижением уровня активного Cdc25С, активатора комплекса циклин В1/CDK1 [181].
Присутствие редокс-чувствительных цистеинов в молекулах убиквитин-активирующего (Е1) и убиквитин-коньюгирующего (Е2) предполагают существование редокс-регуляции процессов деградации белка. Повышение уровня восстановленного глутатиона (GSH) ингибировало активность Е1 и Е2 [182], а также 20S субъединицу протеасомы, препятствуя протеолизу белка [183]. Н2О2, наоборот, стимулировал процессы убиквитинирования, за счет усиления экспрессии E2 и убиквитин-лигазы (Е3) [184].
Резюмируя сказанное выше, важно подчеркнуть следующее: прогрессия клеточного цикла сопровождается не только изменениями уровня циклинов и активности CDK, но и колебаниями соотношения про- и антиоксидантов внутри клетки (окислительно-восстановительного баланса). Исходя из этого, было предположено существование т.н. редокс-цикла внутри клеточного цикла и тесно с ним взаимосвязанного. Пертурбации внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса ведут к нарушениям прогрессии клеточного цикла, указывая на возможность регуляции пролиферации через модуляцию редокс-статуса клетки.
|
