РАЗДЕЛ 3.3. Сравнение антипролиферативного эффекта карнозина с действием его производных
У карнозина существует несколько природных производных, среди них: ацетил-карнозин (N-ацетил-β-аланил-L-гистидин), анзерин (β-аланил-3-метил-L-гистидин), гомокарнозин (у-амино-бутирил-L-гистидин). Для оценки вовлеченности отдельных групп молекулы карнозина в антипролиферативный эффект, действие карнозина сравнивали с эффектом его производных. К среде культивирования клеток U-118-MG добавляли исследуемые соединения в концентрации 40 мМ и оставляли на инкубацию. Каждые два дня в течение 6 дней клетки считали и вычисляли Td, результаты подсчета представлены на Рис. 3.3.1.
Рисунок 3.3.1. Анзерин ингибирует пролиферацию клеток глиобластомы U-118-MG эффективнее, чем другие производные карнозина. К среде культивирования добавляли дипептиды в концентрации 40 мМ и оставляли инкубироваться. Td рассчитывали как описано на Рис 3.2.1. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от Td в контроле; n=3, p<0.05. 
Как следует из Рис. 3.3.1. все исследованные дипептиды приводили к удлинению Td, однако в разной степени, что свидетельствует о существовании взаимосвязи между структурой дипептида и эффективностью ингибирования пролиферации. Ацетил-карнозин обладал наименее выраженным эффектом, увеличивая Td клеток глиобластомы лишь на 3 ч по сравнению с контролем. Td клеток обработанных гомокарнозином и карнозином было примерно одинаковым и превышало контрольное значение на 6 - 7,5 ч. Анзерин ингибировал пролиферацию сильнее, чем остальные соединения. Td клеток обработанных анзерином было на 12 ч длиннее по сравнению с контролем. Полученные результаты свидетельствуют о существовании взаимосвязи между структурой дипептида и эффективностью ингибирования пролиферации. Метилирование молекулы карнозина в положении 1N имидазольного кольца (анзерин) повышает эффективность действия молекулы на процессы клеточной пролиферации. Ацетилирование молекулы по свободной β-аминогруппе карнозина (ацетил-карнозин) приводит к снижению ее эффективности.
Для того чтобы выяснить, связано ли антипролиферативное действие анзерина с изменениями в прогрессии клеточного цикла, клетки обрабатывали 50 – 100 мМ анзерина в течение 24 ч, метили БДУ и измеряли распределение клеток по фазам клеточного цикла на проточном цитометре. На Рис. 3.3.2. продемонстрировано действие 50 – 100 мМ анзерина на прогрессию клеточного цикла клеток U-118-MG. Пример распределения клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с анзерином показан на Рис. 3.3.2.А. результаты анализа процентного распределения представлены на Рис. 3.3.2.Б. Как следует из Рис. 3.3.2.Б, инкубация с анзерином приводила к перераспределению клеток по фазам клеточного цикла. Распределение в контроле составляло: 38% - G1 фаза, 50% - S фаза и 12% - G2 фаза, в пробах обработанных 100 мМ анзерина: 48% - G1 фаза, 27% - S фаза и 25% - G2 фаза. Клетки, обработанные 50 мМ анзерина, не демонстрировали каких либо отличий прогрессии клеточного цикла по сравнению с контролем. Кроме того, было отмечено достоверное увеличение количества клеток в G1 фазе, с 38% в контроле до 48% в присутствии 100 мМ анзерина, что, возможно, является причиной более сильного эффекта анзерина по сравнению с карнозином. Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что характер действия анзерина на клеточный цикл сходен с эффектом карнозина. Дополнительное понижение клеток в G1 фазе под действием анзерина, возможно, является причиной более сильного эффекта анзерина по сравнению с карнозином.
Рисунок 3.3.2. Анзерин индуцирует G2 блок в клетках U-118-MG. Клетки обрабатывали анзерином (50 - 100 мМ) в течение 24 ч, метили БДУ и анализировали с помощью проточного цитометра. (А) Пример распределения БДУ-положительных (S-фаза) и БДУ-отрицательных (G1 и G2 фазы) клеток в контроле и после инкубации с анзерином (100 мМ). (Б) Процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05.
На Рис. 3.3.3. показано влияние гомокарнозина на прогрессию клеточного цикла клеток глиобластомы. Клетки обрабатывали гомокарнозином (100 мМ) в течение 24 ч и измеряли распределение клеток по фазам клеточного цикла на проточном цитометре согласно содержанию ДНК. Результаты измерений представлены на Рис. 3.3.3. Пример распределения клеток между G0/G1, S и G2/М фазами показан на Рис. 3.3.3.А. Согласно результатам анализа процентного распределения клеток представленным на Рис. 3.3.3.Б, распределение в контроле составляло: 48% - G0/G1 фаза, 30,5% - S фаза и 22,5% - G2/М фаза, после инкубации с гомокарнозином: 40% - G0/G1 фаза, 23% - S фаза и 37% - G2/М фаза. Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что гомокарнозин индуцирует G2 блок в клетках U-118-MG. Ингибирующее действие гомокарнозина на пролиферацию клеток глиобластомы, вероятно, связано с изменениями в прогрессии клеточного цикла.
Рисунок 3.3.3. Гомокарнозин индуцирует G2 блок в клетках U-118-MG. Клетки обрабатывали 100 мМ гомокарнозина в течение 24 ч. Содержание ДНК измеряли на проточном цитометре по интенсивности флуоресценции PI. (А) Пример распределения и (Б) процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с гомокарнозином. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от контроля; n=3, p<0.05.
Заключение III: производные карнозина (ацетил-карнозин, анзерин и гомокарнозин) оказывают ингибирующее действие на пролиферацию клеток глиобластомы, однако с разной эффективностью. Метилирование карнозина повышало его антипролиферативные свойства, ацетилирование молекулы, наоборот, приводило к снижению эффективности действия карнозина. Снижение пролиферации глиобластомы под действием анзерина и гомокарнозина, сопровождалось изменениями в прогрессии клеточного цикла и формированием G2 блока.
РАЗДЕЛ 3.4. Возможности применения карнозина в радиотерапии
На сегодняшний день лучевая терапия - один из наиболее эффективных способов лечения глиобластомы. Для того чтобы исследовать, последствия совместного применения карнозина и ионизирующего излучения, клетки обрабатывали карнозином (100 мМ) в течение 24 ч, облучали (4 Гр) и рассаживали в низких разведениях чашки Петри для формирования колоний.
На Рис. 3.4.1. показаны результаты совместного действия карнозина и ионизирующего облучения на гибель клеток глиобластомы. Примеры чашек Петри с колониями клеток сформированных в контроле, после инкубации с 100 мМ карнозина, облучения (4 Гр) и совместного действия карнозина и облучения показаны на Рис. 3.4.1.А. Результаты анализа выживаемости представлены на Рис. 3.4.1.Б. Как следует из Рис. 3.4.1.Б, подсчет количества колоний и расчет выживаемости показали, что инкубация клеток с 100 мМ карнозина приводит к снижению выживаемости клеток глиобластомы до 53% по сравнению с контролем (Рис. VI.Б). Облучение клеток при 4 Гр снижало выживаемость на 67%. Выживаемость клеток, подвергнутых совместному действию карнозина и ионизирующего излучения, составляло 17% от контроля. Таким образом, было продемонстрировано, что предварительная инкубация с карнозином снижает выживаемость клеток глиобластомы под действием ионизирующего излучения.
Рисунок 3.4.1. Предварительная инкубация с карнозином усиливает гибель клеток глиобластомы под действием ионизирующего облучения. Клетки инкубировали с карнозином (100 мМ) в течение 24 ч, облучали (4 Гр) и рассеивали в низких разведениях для формирования колоний. (А) Пример колоний, сформированных в контроле, после обработки карнозином, облучения или после совместного действия карнозина и облучения. (Б) Выживаемость рассчитывали, как описано на рисунке 3.2.3.Б. Звездочки обозначают статистически значимое отличие от выживаемости в контроле (*) или от проб, облученных при 4 Гр (**); n=3, p<0.05.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Карнозин представляет собой природный дипептид встречающийся в высокой концентрации в мышцах и мозге. Антипролиферативный эффект карнозина на трансформированнные и опухолевые клетки был впервые описан порядка 30 лет назад. Однако, механизм ингибирующего действия карнозина на пролиферацию опухолевых клеток до сих пор до конца не понятен. Целью данной работы было исследование механизма ингибирующего действия карнозина на пролиферацию опухолевых клеток. На сегодняшний день в литературе накоплено множество данных об участии про- и антиоксидантов в регуляции клеточной пролиферации. Поскольку, карнозин демонстрирует эффективные антиоксидантные свойства мы предположили, что ингибирующий эффект карнозина на пролиферацию опухолевых клеток является следствием его антиоксидантной активности. Мы обнаружили, что карнозин ингибирует пролиферацию клеток феохромоцитомы крысы (РС-12), глиобластомы человека (U-118-MG), карциномы горла и рта (FaDu, Cal27) и молочной железы (MB231) человека. Наиболее эффективно карнозин ингибировал пролиферацию клеток глиобластомы человека U-118-MG. В данной работе было впервые показано, что снижение пролиферации под действием карнозина сопровождается снижением уровня внутриклеточных АФК, усилением экспрессии MnСОД и циклина В1, а также накоплением клеток в G2 фазе клеточного цикла. Метилированное производное карнозина, анзерин, ингибировал пролиферацию опухолевых клеток эффективнее, чем карнозин. В работе впервые было показано, что обработка клеток глиобластомы карнозином перед облучением приводит к снижению их выживаемости. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что карнозин ингибирует пролиферацию опухолевых клеток за счет активации антиоксидантной системы и модификации клеточного цикла. Метилирование карнозина приводит к усилению антипролиферирующего эффекта. Усиление гибели опухолевых клеток при совместном использовании карнозина и ионизирующего излучения открывает перспективы применения карнозина в терапии опухолевых заболеваний.
Подсчет общего количества клеток феохромоцитомы крысы РС-12 с помощью камеры Горяева выявил снижение количества клеток в пробах обработанных карнозином по сравнению с контролем (Рис. 3.1.1.A). Уменьшение количества клеток не сопровождалось увеличением количества некротических или апоптотических клеток (Рис. 3.1.1.A, 3.1.3.A), указывая на то, что снижение количества клеток происходит в результате замедления пролиферации, а не усиления клеточной гибели. Ингибирующее действие карнозина на пролиферацию клеток было подтверждено результатами измерения времени удвоения популяции. Карнозин увеличивал Td четырех исследованных культур опухолевых клеток человека (карциномы горла и рта (FaDu, Cal27), карцином молочной железы (MB-231), глиобластомы (U-118-MG)). Наибольшее удлинение Td наблюдали в клетках культуры глиобластомы (Рис. 3.2.1). Анализ воздействия разных концентраций карнозина на пролиферацию клеток глиобластомы выявил, что карнозин дозо-зависимо ингибирует рост клеток глиобластомы. Полученные данные подтверждались результатами измерения клеточной выживаемости (Рис. 3.2.3). Наши наблюдения согласовывались с результатами предыдущих работ, демонстрирующими антипролиферативное действие карнозина на клетки, изолированные из мозга больных мультиформной глиобластомой [21, 208]. Снижение количества клеток глиобластомы под действием карнозина не сопровождалось усилением некроза или апоптоза. В пробах, обработанных карнозином, процент клеток включивших БДУ был значительно меньше, чем в контроле, что свидетельствовало о замедление пролиферативных процессов под действием карнозина [208]. Кроме того, инъекции карнозина мышам с ксенографами HER2/neu NIH3T3 фибробластов снижали количество митозов в опухолях и существенно подавляли опухолевый рост [21]. Исходя из полученных нами результатов и данных литературы, был сделан вывод о том, что противоопухолевый эффект карнозина обусловлен ингибирующим действием карнозина на пролиферацию опухолевых клеток.
Причины повышенной чувствительности клеток глиобластомы к карнозину до конца не понятны и требуют дальнейшего изучения. Полученные нами данные позволяют предположить, что одной из причин могут быть различия в уровне эндогенного карнозина в исследованных клеточных культурах. С помощью метода ПЦР в режиме реального времени обнаружено, что в клетках глиобластомы уровень мРНК карнозин-синтетазы ниже, чем в клетках карцином, а уровень мРНК карнозиназы, наоборот, выше (Рис. 3.2.2). Мы полагаем, что изначально низкий уровень эндогенного карнозина в клетках глиобластомы вследствие повышенного уровня карнозиназы и сниженного уровня карнозин-синтетазы, делает клетки U-118-MG более чувствительными к добавлению карнозина извне. Клетки карцином с изначально повышенным уровнем карнозина обладают своего рода резистентностью. Из данного предположения можно также сделать вывод о том, что антипролиферативный эффект карнозина обоснован присутствием молекулы целиком, а не составляющими ее аминокислотами. Результаты более ранних работ подтверждают данное предположение. Показано, что β-аланин сам по себе не проявляет неопластического эффекта, в то время как L-гистидин токсичен для всех типов клеток в концентрации выше 5 мМ [23, 260].
Измерение уровня АФК на проточном цитометре по степени окисления DCFH2-DA выявило, что ингибирование пролиферации клеток РС-12 и U-118-MG под действием карнозина сопровождается снижением внутриклеточного уровня АФК (Рис. 3.1.2 и 3.2.4). Наши наблюдения согласуются с опубликованными ранее данными, демонстрирующими корреляцию между снижением внутриклеточного уровня АФК и уменьшением количества клеток карциномы толстой кишки человека HCT116 под действием карнозина [209]. Показано, что внутриклеточный уровень АФК повышается по мере прогрессии клеток через клеточный цикл, позволяя предположить, что быстро пролиферирующие клетки находятся в более окисленном состоянии по сравнению с клетками, делящимися медленно [32, 33]. Высокий уровень АФК в опухолевых клетках, вероятно, является одной из причин их активной пролиферации [69]. Исходя из данных литературы и наших результатов, мы предполагаем, что снижение внутриклеточного уровня АФК в клетках РС-12 и U-118-MG под действием карнозина, способствует замедлению пролиферации клеток глиобластомы.
Интересно отметить, что усиление экспрессии карнозиназы (CN1) в клетках нейробластомы человека SH-SY5Y приводило к снижению защитного действия карнозина от цитотоксического эффекта известного индуктора окислительного стресса, малонового диальдегида [9]. Таким образом, прослеживается параллель между ослаблением антипролиферативного эффекта и антиоксидантных свойств карнозина при усилении экспрессии карнозиназы, указывая на существование взаимосвязи между способностью карнозина снижать уровень АФК и ингибировать пролиферацию опухолевых клеток.
При дальнейшем исследовании действия карнозина на антиоксидантную систему клеток глиобластомы было обнаружено, что карнозин изменяет активность, основных ферментов антиоксидантной системы клетки, MnСОД и каталазы. С помощью метода электорофореза в неденатурирующем геле было выявлено усиление активности MnСОД в клетках глиобластомы обработанных карнозином (Рис. 3.2.5.А). С помощью методов иммуноблоттинга и ПЦР в реальном времени было установлено, что усиление активности MnСОД сопровождается повышением уровня белка и мРНК MnСОД (Рис. 3.2.5.Б-Г). MnСОД представляет собой антиоксидантный фермент, локализованый в митохондриях и катализирующий реакцию дисмутации супероксида в пероксид водорода [50]. Ранее мы показали, что прогрессия клеточного цикла зависит от активности MnСОД: повышение активности MnСОД ингибировало клеточный рост, в то время как понижение активности MnСОД усиливало пролиферацию [27, 151, 261]. Более того, в нескольких исследованиях было продемонстрировано значительное снижение активности MnСОД в опухолевых клетках, что совпадало с повышенным внутриклеточным уровнем АФК и активной пролиферацией. Усиление экспрессии MnСОД ингибировало пролиферацию многих линий опухолевых клеток, в том числе клеток глиобастомы человека U-118 [30, 74, 75, 256, 262, 263]. В нашей работе, увеличение активности MnСОД при инкубации клеток глиобластомы с карнозином сопровождалось значительным удлинением времени удвоения популяции. Следовательно, можно предположить, что антипролиферативный эффект карнозина обусловлен его способностью усиливать экспрессию MnСОД и приводить к снижению уровня АФК.
|
