Измерение активности цитозольной формы СОД (CuZnСОД) в контроле и после инкубации с карнозином не выявило каких-либо различий. Поскольку MnСОД представляет собой антиоксидантный фермент расположенный в матриксе митохондрий, исходя из полученных данных можно предположить, что антипролиферативный эффект карнозина является результатом изменения уровня АФК, генерируемых в митохондриях.
Интересно отметить работу Renner et al., которые показали, что уменьшение количества клеток глиобластомы в культуре под действием карнозина сопровождается снижением внутриклеточного количества АТФ и активности ЛДГ, что, по мнению авторов, являлось причиной замедления пролиферации опухолевых клеток [21, 208]. Ингибирование окислительного фосфорилирования с помощью KCN не влияло на выработку АТФ или выживаемость клеток глиобластомы, исходя из этого было предположено, что карнозин работает на уровне гликолиза, а не окислительного фосфорилирования [225]. Недавно Sarsour et al. продемонстрировали существование взаимосвязи между гликолизом и активностью MnСОД. Понижение активности MnСОД сопровождалось усилением интенсивности поглощения глюкозы, а усиление активности MnСОД, наоборот ингибировало гликолитические процессы [27]. Таким образом, можно предположить, что обнаруженное нами повышение активности MnСОД под действием карнозина является одним из механизмов ингибирующего действия карнозина на гликолиз, приводя к замедлению пролиферации опухолевых клеток.
Измерение активности каталазы в пробах обработанных карнозином выявило снижение ее активности в клетках глиобластомы обработанных карнозином по сравнению с контролем (Рис. 3.2.6). Снижение активности каталазы сопровождалось понижением уровня белка. Каталаза является важным участником антиоксидантной системы клетки, который катализирует реакцию разложения Н2О2 до воды и молекулярного кислорода. Таким образом, снижение активности каталазы должно приводить к повышению концентрации Н2О2, однако в нашей работе этого не наблюдалось. Более того, уровень АФК, наоборот, снижался. Возможно, это происходило потому, что изначальная активность каталазы была невелика (4 мк ед/мг). В то время как средняя активность каталазы в нормальных клетках на несколько порядков выше (примерно 5 ед/мг белка) [148]. Понижение активности каталазы в клетках глиобластомы с 4 до 2 мк ед/мг, вероятно, не вносило значительного вклада в повышение уровня Н2О2. Кроме того, снижение уровня АФК может объясняться включением компенсаторных механизмов, например усилением активности GPx, пероксиредоксинов и т.п.
Исследование влияния карнозина на прогрессию клеточного цикла клеток РС-12 и U-118-MG выявило, что замедление пролиферации под действием карнозина сопровождается увеличением количества клеток в G2 фазе (Рис. 3.2.7). На сегодняшний день накоплен большой объем экспериментальных данных, указывающий на важность роли АФК в регуляции прогрессии клеточного цикла. Показано, что по мере прогрессии клеточного цикла от G1 к митозу происходит увеличение уровня АФК и снижение активности MnСОД. Концентрация АФК максимальна в поздней S фазе и в G2/M [26]. Активность MnСОД, наоборот, была максимальна в G1 фазе и постепенно снижалась по мере прогрессии через S, G2 и М фазы [27, 148, 150]. Повышение экспрессии MnСОД усиливало формирование G2 блока индуцированное действием радиации в клетках карциномы [180]. Исходя из полученных нами результатов и данных литературы, мы предполагаем, что индуцированное карнозином снижение АФК и увеличение активности MnСОД приводят к нарушению внутриклеточного редокс-баланса, необходимого для прогрессии через G2 фазу (повышенный уровень АФК и низкая активность MnСОД). В результате не происходит активации редокс-зависимых регуляторов G2 фазы, что приводит к нарушению прогрессии клеточного цикла через G2 фазу.
В нашей лаборатории было также показано, что карнозин замедляет рост уровня активной формы МАР-киназы ERK1/2 в условиях окислительного стресса индуцированного активацией глутаматных рецепторов [234, 236]. Активация ERK1/2 необходима для пролиферации клеток, ингибирование ERK1/2 приводило к остановке пролиферации и накоплению клеток в одной из фаз клеточного цикла [106]. Есть данные о том, что активность ERK1/2 изменяется в зависимости от состояния редокс. Например, усиление экспрессия MnСОД подавляло активацию ERK1/2 в клетках глиобластомы человека U87, указывая на возможность регуляции активности ERK1/2 с помощью антиоксидантов [28, 160]. Несмотря на то, что для проверки данной гипотезы, необходимо проведение множества дополнительных экспериментов, мы полагаем, что ингибирование ERK1/2 при активации MnСОД и снижении уровня АФК под действием карнозина, может быть одним из механизмов его антипролифативного эффекта.
Увеличение количества G2 клеток сопровождалось усилением экспрессии циклина В1. Циклин В1 представляет собой функциональную субъединицу комплекса циклин В1/CDK1, который регулирует прогрессию клетки через G2 фазу (Рис. 3.2.8) [131]. Экспрессия циклина В1 усиливается в поздней S-фазе, достигает максимума в G2, и резко снижается в середине митоза. В G1-фазе циклин В1 не детектируется [81]. Таким образом, увеличение уровня циклина В1 в пробах обработанных карнозином может быть следствием повышенного содержания клеток в G2-фазе. С другой стороны, карнозин может напрямую активировать экспрессию циклина В1 независимо от индукции G2-блока. Дополнительные исследования необходимы для изучения механизма активации экспрессии циклина В1 в ответ на действие карнозина.
Мы полагаем, что индукция G2 блока под действием карнозина может быть также опосредована через фосфатазу Cdc25C, которая является редокс-чувствительным ферментом и играет важную роль в регуляции работы комплекса циклин В1/CDK1 [138, 177]. Thomas et al. показали, что низкомолекулярный антиоксидант витамин С индуцирует G2 блок в клетках HeLa и T98G. При более подробном исследовании механизма данного явления было выявлено, что витамин С препятствует перемещению Cdc25C в ядро, а следовательно и активации комплекса циклин В1/CDK1 [181]. В результате, несмотря на наличие комплекса циклин В1/CDK1 в клетке прогрессии клеточного цикла не происходило. Нами также было замечено, что рост уровня циклина В1 начинался одновременно с ростом уровня белка MnСОД, подтверждая наше предположение о том, что увеличение активности MnСОД приводит к изменениям в прогрессии клеточного цикла и формированию G2 блока. Исходя из наших данных, сопоставленных с данными литературы, был сделан вывод о том, что индуцированные карнозином изменения в соотношении внутриклеточных про- и антиоксидантов индуцирует G2 блок и увеличивают уровень циклина В1.
У карнозина существует несколько природных производных, среди них: ацетил-карнозин (N-ацетил-β-аланил-L-гистидин), анзерин (β-аланил-3-метил-L-гистидин), гомокарнозин (у-амино-бутирил-L-гистидин). Изучение структурно-функциональных особенностей карнозина и его производных в отношении подавления пролиферации опухолевых клеток может помочь оценить степень вовлеченности отдельных частей молекулы в исследуемый эффект карнозина. Исследование антипролиферативых свойств производных карнозина выявило, что все исследованные производные карнозина ингибировали пролиферацию опухолевых клеток. Эффективность действия исследованных дипептидов возрастала в следующем порядке: ацетил-карнозин < карнозин ≤ гомокарнозин < анзерин (Рис. 3.1.4.А, 3.3.1, 3.3.2, 3.3.3). Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла в контроле и пробах обработанных дипептидами показал, что все исследованные вещества индуцируют накопление клеток в G2 фазе клеточного цикла. Клетки U-118-MG обработанные анзерином также демонстрирововали небольшое увеличение количества клеток в G1 фазе, что, возможно, было причиной более сильного антипролиферативного эффекта анзерина. Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что ацетилирование карнозина снижает его антипролиферативные способности, в то время как метилирование, наоборот, усиливает антипролиферативный эффект.
Характер влияния заместителей в молекуле карнозина на его антипролиферативные свойства был сходен с характером влияния заместителей на антиоксидантную активность карнозина. Согласно эффективности защиты суперскрученной ДНК от перекисного окисления липидов индуцированного в смеси Фентона дипептиды располагались следующим образом: гистидин < ацетил-карнозин < гомокарнозин ≤ карнозин ≤ анзерин [15, 264]. Совпадение принципов изменения силы антиоксидантного и антипролиферативного эффектов еще раз указывает на сопряженность между антиоксидантным и антипролиферативным свойствами карнозина.
Синтетический аналог карнозина - L-гистидин-β-аланин, представляющий собой т.н. «карнозина наоборот» также индуцировал накопление клеток в G2 фазе клеточного цикла и ингибировал пролиферацию опухолевых клеток (Рис. 3.1.4.Б). Причем, диапазон эффективных концентраций для антипролиферативного эффекта L-гистидин-β-аланина был в 10 раз ниже (5 – 10 мМ), чем для карнозина (50 - 100 мМ). Однако, при концентрации выше 10 мМ L-гистидин-β-аланин приводил к интенсивной гибели опухолевых клеток. Токсичность «карнозина наоборот» может быть связана с положением L-гистидина на первом месте. Известно, что в концентрации выше 5 мМ гистидин обладает цитотоксическими действием. Добавление β-аланина к молекуле гистидина в молекуле карнозина, вероятно, способствует снижению токсичности гистидина. Было показано, что токсичность гистидина связана с присутствием ионов железа, удаление ионов железа из среды снижало токсический эффект гистидина. Имидазольное кольцо в молекуле гистидина способно хелатировать железо, отдавая протон от азота 1N. Металлы в металлоферментах часто координируются с помощью гистидина через незащищенный азот в имидазоле. Предполагается, что гистидин способен отнимать т.н. «хелатируемое железо», железо слабосвязанное с внутриклеточными ферментами, и делать его более доступным для окисления под действием АФК [265, 266]. Перемещение L-гистидина на первое место в молекуле «карнозина наоборот» делает имидазольное кольцо более открытым, и, следовательно, более доступным для взаимодействий, что, вероятно, является причиной цитотоксичности высоких концентраций L-гистидин-β-аланина.
Инкубация с синтетическим трипептидом пинеалоном приводила к снижению внутриклеточного уровня АФК в клетках РС-12 по сравнению с необработанным контролем (Рис. 3.1.5.А). Наши результаты согласовывались с полученными ранее данными об антиоксидантных свойствах пинеалона, продемонстрированных на модели гиперборической гипоксии [244-246]. Кроме того, на клетках РС-12 мы показали, что пинеалон обладает защитным антиоксидантным действием. Пинеалон частично препятствовал росту внутрикелточного уровня АФК индуцированного действием Н2О2 и снижал уровень клеточной гибели (Рис. 3.1.5). Анализ клеточного цикла выявил, что подобно карнозину, инкубация с пинеалоном приводит к увеличению количества S и G2/М клеток по сравнению с контролем (Рис. 3.1.6). Однако, для достижения сходного эффекта пинеалон требовался в концентрациях на несколько порядков ниже, чем карнозин (нМ – для пинеалона, мМ – для карнозина). Ранее в нашей лаборатории было показано, что пинеалон препятствует росту ERK1/2 в гранулярных клетках мозжечка индуцированное действием уабаина [234]. Поскольку активация ERK1/2 необходима для прогрессии клеточного цикла, снижение активности ERK1/2 под действием пинеалона может быть одним из механизмов индукции G2 блока в его присутствии. Кроме того, аминокислотный состав пинеалона и карнозина различается, указывая на то, что действие исследуемых короткоцепочечных пептидов на клеточный цикл, видимо, обосновано не присутствием конкретной аминокислоты, а скорее всего антиоксидантными свойствами веществ.
Глиобластома – это наиболее частая и агрессивная форма опухоли головного мозга [269]. На сегодняшний день лечение глиобластомы носит скорее паллиативный характер и продлевает жизнь больного максимум на 2 года [270]. Одним из наиболее эффективных способов лечения глиобластомы является лучевая терапия, применение которой ограничено повреждающим действием на нормальные ткани. Соединения, способные усиливать гибель опухолевых клеток, предохраняя при этом нормальные ткани, представляют собой одно из наиболее актуальных направлений исследований.
С помощью колониеформирующего метода было продемонстрировано, что предварительная инкубация клеток глиобластомы с карнозином приводит к снижению выживаемости клеток после действия ионизирующего излучения по сравнению с контролем (Рис. 3.4.1). Ранее было показано, что обработка нормальных клеток карнозином снижает последствия повреждающего действия радиации. Введение мышам карнозина в течение нескольких дней перед облучением способствовало повышению выживаемости животных и сопровождалось увеличением эффективности образования селезеночных колоний гематопоэтическими стволовыми клетками из костного мозга облученных животных [218-220]. Кроме того, карнозин снижал степень повреждения плазмиды ДНК и количество разрывов в цепи ДНК, индуцированные действием ионизирующего излучения [271]. Исходя из полученных нами данных мы предполагаем, что карнозин способен избирательно снижать выживаемость опухолевых клеток под действием ионизирующего излучения, защищая при этом нормальные клетки. Полученные нами данные могут быть использованы на практике для разработки протоколов применения карнозина в терапии опухолей головного мозга.
ВЫВОДЫ
1. Исследован характер воздействия карнозина на пролиферацию культур опухолевых клеток: феохромоцитомы крысы (РС-12), карциномы горла и рта (FaDu и Cal27), карциномы молочной железы (MB231) и глиобластомы человека (U-118-MG). Обнаружено, что карнозин ингибирует пролиферацию всех исследованных клеточных линий. Наиболее выраженный эффект проявлялся на клетках глиобластомы человека U-118-MG;
2. Изучено влияние карнозина на уровень АФК и активность антиоксидантных ферментов глиобластомы. Выявлено, что ингибирование пролиферации клеток глиобластомы под действием карнозина сопровождается снижением уровня АФК и увеличением активности MnСОД;
3. Исследовано воздействие карнозина на клеточный цикл клеток РС-12 и U-118-MG. Установлено, что изменения в антиоксидантной системе сопровождаются накоплением клеток в G2 фазе клеточного цикла и усилением экспрессии циклина В1;
4. Проведено сравнение антипролиферативного эффекта карнозина с действием его производных и синтетического трипептида пинеалона. Выявлено, что метилированное производное карнозина, анзерин, ингибирует пролиферацию клеток опухолевых клеток эффективнее, чем карнозин;
5. Исследован эффект совместного применения карнозина и ионизирующего излучения на гибель опухолевых клеток. Обнаружено, что предварительная инкубация клеток с карнозином снижает выживаемость клеток глиобластомы под действием ионизирующего излучения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Mannion, A.F., et al., Carnosine and anserine concentrations in the quadriceps femoris muscle of healthy humans. Eur J Appl Physiol Occup Physiol, 1992. 64(1): p. 47-50.
2. Margolis, F.L., Carnosine in the primary olfactory pathway. Science, 1974. 184(4139): p. 909-11.
3. Kalyankar, G.D. and A. Meister, Enzymatic synthesis of carnosine and related beta-alanyl and gamma-aminobutyryl peptides. J Biol Chem, 1959. 234: p. 3210-8.
4. Stenesh, J.J. and T. Winnick, Carnosine-anserine synthetase of muscle. 4. Partial purification of the enzyme and further studies of beta-alanyl peptide synthesis. Biochem J, 1960. 77(3): p. 575-81.
5. Skaper, S.D., S. Das, and F.D. Marshall, Some properties of a homocarnosine-carnosine synthetase isolated from rat brain. J Neurochem, 1973. 21(6): p. 1429-45.
|
