РАЗДЕЛ 3.1. Изучение характера действия карнозина и его производных на опухолевые клетки
Антипролиферативный эффект карнозина на опухолевые и трансформированные клетки был продемонстрирован на ряде различных моделей [20, 21, 23, 208], однако механизм регуляции клеточной пролиферации с помощью карнозина до сих пор остается до конца не исследованным.
3.1.1. Карнозин снижает количество клеток РС-12 в культуре
Для изучения влияния карнозина на пролиферацию опухолевых клеток, была выбрана культура клеток феохромоцитомы крысы РС-12. Клетки обрабатывали карнозином (10 - 50 мМ) в течение 48 ч и затем считали количество клеток в каждой пробе с помощью камеры Горяева.
Рисунок 3.1.1. Карнозин снижает количество клеток РС-12 в культуре. Клетки обрабатывали карнозином (10 - 50 мМ) в течение 48 ч. (А) Общее количество клеток подсчитывали в камере Горяева. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05. (В) Процент погибших клеток определяли с помощью проточного цитометра по количеству клеток меченных PI. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества некротических клеток в контроле; n=3, p<0.05.
На Рис. 3.1.1.А. представлены результаты подсчета количества клеток в контроле и пробах обработанных карнозином. Как следует из Рис. 3.1.1.А, инкубация с карнозином приводила к дозо-зависимому снижению количества клеток РС-12. Количество клеток в пробах обработанных 10 мМ карнозина составляло 69% от контроля, 25 мМ – 52%, 50 мМ – 45%. Уменьшение количества клеток происходит в результате их гибели или при замедлении пролиферации. Для того чтобы выяснить, усиливает ли карнозин гибель клеток РС-12 клетки обрабатывали карнозином (10 – 50 мМ) в течение 48 ч, окрашивали маркером погибших клеток, PI, и анализировали интенсивность флуоресценции PI на проточном цитометре. Из Рис. 3.1.1.Б. видно, что достоверных различий в количестве погибших клеток в контроле и пробах, обработанных карнозином, обнаружено не было (Рис. I.1.Б). Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что снижение общего количества клеток РС-12 под действием карнозина не связано с гибелью клеток и, предположительно, является результатом замедления пролиферации.
3.1.2. Карнозин снижает уровень АФК в клетках культуры РС-12
Рисунок 3.1.2. Карнозин снижает уровень АФК в клетках РС-12. Клетки инкубировали с 50 мМ карнозина в течение 0,5 - 48 ч. Уровень АФК измеряли на проточном цитометре по степени окисления DCFH2-DA. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от уровня АФК в контроле; n=3, p<0.05. 
Быстро пролиферирующие клетки часто характеризуются повышенным содержанием АФК. Понижение уровня АФК в этих клетках с помощью антиоксидантов приводит к снижению скорости пролиферации [26, 66, 149]. Принимая во внимание способность карнозина взаимодействовать с некоторыми видами АФК и снижать их реакционную способность [15-19] можно предположить, что замедление клеточной пролиферации под действием карнозина является результатом его антиоксидантного эффекта. Для того чтобы выяснить, сопровождается ли снижение количества клеток РС-12 под действием карнозина изменениями уровня АФК, клетки РС-12 обрабатывали карнозином (50 мМ) в течение 0,5 - 48 ч. Уровень АФК измеряли на проточном цитометре по степени окисления флуоресцентного красителя DCFH2-DA, результаты измерения представлены на Рис. 3.1.2. Как следует из Рис. 3.1.2, уже через 30 мин инкубации уровень АФК в пробах с карнозином снижался на 50% по сравнению с контролем. Пониженный уровень АФК поддерживался на протяжении 24 ч и возвращался к контрольному уровню через 48 ч. Поскольку снижение уровня АФК по времени предшествовало снижению количества клеток (Рис. 3.1.1.Б), можно предположить, что индуцированное карнозином замедление пролиферации клеток РС-12 является результатом его антиоксидантного эффекта.
3.1.3. Карнозин и его производные индуцируют накопление клеток РС-12 в S и G2/М фазах клеточного цикла
Пролиферация - это процесс увеличения количества клеток путем деления. Период времени от образования новой клетки до ее деления на две называется клеточным циклом. Клеточный цикл представляет собой совокупность последовательных строго организованных переходов от G1 фазы к S, к G2 и М (митоз). Нарушение прогрессии клеточного цикла ведет к его остановке (блоку) и препятствует дальнейшей пролиферации [81]. Для того чтобы выяснить, связано ли индуцируемое карнозином снижение количества клеток РС-12 с изменениями в прогрессии клеточного цикла, клетки РС-12 обрабатывали карнозином (10 - 50 мМ) в течение 48 ч. По истечении периода инкубации клетки фиксировали, окрашивали PI и с помощью проточного цитометра измеряли количество клеток в G0/G1, S и G2/М фазах по интенсивности флуоресценции PI. На Рис. 3.1.3.А. представлен пример распределения клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с 50 мМ карнозина. Результаты анализа процентного распределения клеток по фазам клеточного цикла представлены на Рис. 3.1.3.Б.
Рисунок 3.1.3. Карнозин индуцирует накопление клеток РС-12 в S и G2/М-фазах клеточного цикла. Клетки инкубировали с карнозином (5 - 50 мМ) в течение 48 ч. Содержание ДНК измеряли на проточном цитометре по интенсивности флуоресценции PI. (А) Пример распределения клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с 50 мМ карнозина. (Б) Процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после обработки карнозином. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05.
Как следует из Рис. 3.1.3.Б, карнозин дозо-зависимо увеличивал количество клеток в S и G2/M фазах клеточного цикла. Параллельно происходило снижение количества клеток в G0/G1 фазе. Достоверно отличимый от контроля результат был получен при концентрациях 25 - 50 мМ карнозина. В пробах, обработанных 50 мМ карнозина, число S и G2/M клеток возрастало, соответственно, до 15% и 22%, по сравнению с 12% и 17% в контроле. Количество G0/G1 клеток при этом снижалось до 62% по сравнению с 71% в контроле. Важно отметить, что увеличения количества апоптотических клеток под действием карнозина выявлено не было (отсутствует sub-G1 пик, Рис. 3.1.3.А). Это еще раз подтверждает способность карнозина воздействовать на процессы клеточной пролиферации, а не гибели. Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что снижение количества клеток РС-12 под действием карнозина происходит в результате замедления прогрессии клеточного цикла и накопления клеток в S и G2/М фазах клеточного цикла.
У карнозина есть несколько природных производных, среди которых наиболее изученными являются ацетил-карнозин (N-ацетил-β-аланил-L-гистидин) и анзерин (у-амино-бутирил-L-гистидин). Изучение структурно-функциональных взаимосвязей между карнозином и его производными в отношении изменения прогрессии клеточного цикла клеток РС-12 может помочь оценить степень вовлеченности отдельных частей молекулы в исследуемый эффект карнозина. Для того чтобы сравнить, изменения в прогрессии клеточного цикла под действием карнозина и его производных, клетки обрабатывали 50 мМ карнозина, анзерина или ацетил-карнозина в течение 48 ч и анализировали распределение клеток по фазам клеточного цикла согласно содержанию ДНК (Рис. 3.1.4). Как видно из Рис. 3.1.4.А, все исследованные вещества индуцировали накопление клеток в S и G2/М фазах, однако наиболее выраженный эффект демонстрировал анзерин. В пробах обработанных анзерином количество S и G2/М клеток возрастало, соответственно, на 79% и 65%. А количество G0/G1 клеток уменьшалось на 21%. Наименее выраженный эффект демонстрировал ацетил-карнозин. Основываясь на полученных данных, было сделано заключение о том, что метилирование карнозина способствует усилению ингибирующего эффекта на прогрессию клеточного цикла, в то время как ацетилирование карнозина этот эффект ослабляет.
Рисунок 3.1.4. Анзерин и L-гистидин-β-аланин замедляют прогрессию клеточного цикла эффективнее, чем карнозин. Клетки РС-12 инкубировали с карнозином и его производными в течение 48 ч. Содержание ДНК измеряли на проточном цитометре по интенсивности флуоресценции PI. Процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с 50 мМ карнозина, анзерина, ацетил-карнозина (А) или 1 - 10 мМ L-гистидин-β-аланина (Б). Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05.
Синтетическое производное карнозина L-гистидин-β-аланин, представляющий собой последовательность аминокислот карнозина в обратном порядке (т.н. «Карнозин наоборот») эффективнее, чем карнозин индуцировал накопление клеток в S и G2/М фазах клеточного цикла (Рис. 3.1.4.Б). Клетки обрабатывали L-гистидин-β-аланином в концентрации 1 - 10 мМ в течении 48 ч, затем с помощью проточного цитометра изучали распределение клеток по фазам клеточного цикла согласно содержанию ДНК. Достоверно отличимый от контроля результат наблюдали при концентрации 5 – 10 мМ, то есть в 5 раз ниже, чем для карнозина. Причем, под действием 10 мМ L-гистидин-β-аланина количество S и G2/М клеток возрастало на 80% и 60% соответственно, что превышало значения, полученные под действием 50 мМ карнозина. В концентрации выше 10 мМ L-гистидин-β-аланин проявлял токсическое действие, поскольку приводил к гибели более 90% клеток. Таким образом, L-гистидин-β-аланин замедлял прогрессию клеточного цикла эффективнее, чем карнозин, однако обладал сильным цитотоксическим эффектом.
3.1.4. Изучение воздействия синтетического трипептида пинеалона на клеточный цикл
Пинеалон представляет собой синтетический трипептид (Glu-Asp-Arg), синтезированный на основе анализа экстракта коры головного мозга крупного рогатого скота и проявляющий эффективные антиоксидантные свойства [244-246]. Для изучения эффекта пинеалона на внутриклеточный уровень АФК клетки РС-12 обрабатывали пинеалоном (50 – 500 нМ) в течение 1 ч, а затем индуцировали окислительный стресс добавлением 1 мМ пероксида водорода (Н2О2) на 20 мин. Уровень АФК измеряли с помощью проточного цитометра по степени окисления флуоресцентного красителя DCFH2-DA. Процент погибших клеток определяли по количеству клеток окрашенных PI. Результаты измерения внутриклеточного уровня АФК и процента погибших клеток представлены на Рис. 3.1.5. Как видно из Рис. 3.1.5.А. обработка клеток РС-12 пинеалоном 50 - 500 нМ приводила к снижению внутриклеточного уровня АФК на 40% по сравнению с контролем. Добавление Н2О2 индуцировало рост АФК. Уровень АФК в пробах обработанных 1 мМ Н2О2 в 5 раз превышал значение в контроле. Инкубация клеток с пинеалоном частично препятствовала увеличению уровня АФК под действием Н2О2. Клетки, обработанные пинеалоном (50 - 500 нМ) перед добавлением Н2О2, демонстрировали в 2 раза меньший уровень АФК, чем клетки обработанные только Н2О2. Параллельно с повышением уровня АФК под действием Н2О2 происходило увеличение клеточной гибели. В пробах обработанных Н2О2 количество погибших клеток составляло 42,5% по сравнению с 5% в контроле. Пинеалон (50 – 500 нМ) снижал количество погибших клеток до 32,5 – 20% (Рис. 3.1.5.Б). Таким образом, было продемонстрировано, что пинеалон снижает внутриклеточный уровень АФК, предотвращает развитие окислительного стресса индуцированного действием Н2О2 и защищает клетки РС-12 от гибели.
Рисунок 3.1.5. Пинеалон снижает уровень АФК в клетках РС-12 и уменьшает клеточную гибель. Клетки обрабатывали пинеалоном (50 – 500 нМ), через 1 час добавляли 1 мМ пероксида водорода (Н2О2), инкубировали 20 мин и анализировали на проточном цитометре. (А) Уровень АФК в контроле и в клетках обработанных пинеалоном и Н2О2 измеренный по степени окисления флуоресцентного красителя DCFH2-DA. (Б) Процент погибших клеток определенный по количеству клеток окрашенных PI. Звездочки обозначают статистически значимое отличие от количества клеток в контроле (*) или в присутствии 1 мМ Н2О2 (**); n=3, p<0.05.
Для того чтобы выяснить, способен ли пинеалон ввиду своих антиоксидантных свойств модифицировать прогрессию клеточного цикла клетки РС-12 обрабатывали пинеалоном (50 - 500 нМ) в течение 24 ч и с помощью проточного цитометра анализировали распределение клеток по фазам клеточного цикла согласно содержанию ДНК.
Рисунок 3.1.6. Пинеалон индуцирует накопление клеток в S и G2/М фазах клеточного цикла. Клетки обрабатывали пинеалоном (50 - 500 нМ) в течение 24 часов. Распределение клеток по фазам клеточного цикла анализировали на проточном цитометре по интенсивности флуоресценции PI. (А) Пример распределения клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после обработки пинеалоном. (В) Процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05.
На Рис. 3.1.6.А. представлен пример распределения клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после обработки пинеалоном 100 нМ. Процентное распределение клеток между G0/G1, S и G2/М фазами в контроле и в пробах обработанных пинеалоном (50 – 500 нМ) показано на Рис. 3.1.6.Б. Как следует из Рис. 3.1.6.Б, пинеалон приводил к дозо-зависимому увеличению количества клеток в S и G2/М фазах и снижению количества клеток в G0/G1 фазе. Распределение в контроле составляло: G0/G1 - 70%, S - 14%, G2/М - 16%. Достоверно отличимый от контроля результат был получен в клетках, обработанных 100 нМ и 500 нМ пинеалона и составлял, соответственно: G0/G1 - 55%, S - 21%, G2/М -24% и G0/G1 - 50%, S - 24%, G2/М - 26%. Существенного влияния пинеалона на количество апоптотических клеток выявлено не было (Рис. 3.1.6.Б). Исходя из полученных, данных был сделано предположение о том, что пинеалон проявляет антиоксидантные свойства в клетках РС-12, а также индуцирует накопление клеток в G2/М фазе клеточного цикла.
Заключение I: Ингибирующее действие карнозина на пролиферацию клеток феохромоцитомы крысы РС-12 сопровождалось модификацией клеточного цикла и накоплением клеток в S и G2/М фазах. Метилирование карнозина приводило к усилению формирования G2-блока, а ацетилирование молекулы этот эффект ослабляло. L-гистидин-β-аланин (т.н. “карнозин наоборот”) демонстрировал в 5 раз большую эффективность по сравнению с карнозином, однако обладал сильным цитотоксическим эффектом. Синтетический трипептид пениалон также демонстрировал антиоксидантные свойства и индуцировал накопление клеток в S и G2/М фазах. Однако концентрации пинеалона были на несколько порядков ниже, чем для карнозина. Поскольку изменениям в прогрессии клеточного цикла под действием карнозина предшествовало снижение внутриклеточного уровня АФК, было предположено, что существует взаимосвязь между антипролиферативным и антиоксидантным эффектами карнозина.
|
