РАЗДЕЛ 1.3. Современное состояние знаний о противоопухолевом эффекте короткоцепочечных пептидов
1.3.1. Карнозин и его производные. Общая характеристика
Карнозин представляет собой природный короткоцепочечный пептид, состоящий из двух аминокислот – β-аланина и L-гистидина. В организме человека карнозин представлен во многих тканях (мышцы, мозг, печень, ткани глаза, желудок, почки, легочная ткань), достигая наиболее высокой концентрации в скелетных мышцах (~ 20 мM) и в обонятельных луковицах головного мозга (~ 2.5 мM) [1, 2].
Карнозин синтезируется с помощью фермента карнозин-синтетазы [3-6], которая катализирует образование пептидной связи между β-аланином и L-гистидином, используя энергию АТФ и ионы Mg2+:
β-аланин + L-гистидин + АТФ = карнозин + Pi + АДФ [7]
Карнозин-синтетаза относится к семейству ATP-grasp ферментов, катализирующих АТФ-зависимое присоединение карбоксила одной молекулы к амино- или тиоловой группе другой с образованием АДФ и органического фосфата (Pi) [185]. Ген карнозин-синтетазы располагается в 11q13 хромосоме человека и экспрессируется главным образом в мозге и мышцах [7]. Bauer et al. показали, что карнозин и его производные синтезируется в основном клетками глии. Интересно, что опухолевые клетки, глиомы С6, тоже активно синтезировали карнозин и родственные соединения [186]. Синтез карнозина в нейронах обнаружен не был, однако нейроны были способны поглощать карнозин из среды и метаболизировать его [187-190]. Интересно отметить, что усиление синтеза карнозина сопровождалось дифференцировкой глиальных клеток, что оценивалось по усилению иммуноокрашивания антителами к маркерам дифференциации [189]. Сходный эффект наблюдали при обработке скелетных мышц новорожденных цыплят. Усиление синтеза карнозина замедляло скорость деления клеток и способствовало превращению миобластов в миотубулы [191, 192].
В организме человека существует два фермента, способных расщеплять карнозин на составные аминокислоты: сывороточная (CN1) [193] и тканевая/цитозольная (CN2) карнозиназы [194, 195]. CN1 экспрессируется главным образом в мозге, и в меньшей степени в печени. Иммуногистохимическое исследование выявило присутствие CN1 в цитозоле пирамидальных нейронов гиппокампа, а также в больших и малых нейронах коры больших полушарий. Цитозольная фракция клеток, секретирующих CN1, не деградировала карнозин, указывая на то, что CN1 относится к секретируемым белкам и активен только после секреции [9]. В отличие от CN1, CN2 экспрессируется повсеместно в тканях человека и является цитозольным ферментом. Больше всего этого фермента содержится в почках и печени, в меньшем количестве обнаружен в мозге, селезенке и поджелудочной железе, следовые количества – в легких, семенниках и яичниках, отсутствует в сердце [9]. Ферменты характеризуются разными рН-оптимумами работы. CN1 демонстрирует наибольшую активность при рН 7,5 – 8,5, CN2 характеризуется более узким оптимумом работы рН с максимумом около рН 9,5. Таким образом, при физиологических pH карнозин гидролизуется преимущественно с помощью CN1 [9]. Интересно отметить, что экспрессия CN1 отсутствует в пренатальном периоде и у новорожденных, что указывает на усиление экспрессии CN1 с возрастом [9, 196]. Кроме того, у пожилых людей обнаружен более низкий уровень гомокарнозина в сыворотке крови по сравнению с молодым поколением [197].
У карнозина существует несколько природных производных, в том числе: N-ацетил-карнозин (N-ацетил-β-аланил-L-гистидин), анзерин (β-аланил-1-метил-L-гистидин) и гомокарнозин (у-амино-бутирил-L-гистидин) (см. Рис. 1.5). Считается, что β-аланил-содержащие дипептиды преимущественно располагаются в скелетных мышцах, в то время как дипептиды содержащие γ-амино-масленную кислоту (ГАМК) типичны для центральной нервной системы [7]. Ацетилированная форма карнозина присутствует в сердечной мышце и в мозге [198]. Предполагается, что образование ацетилкарнозина происходит за счет ацетилирования карнозина, однако информация о ферментах, катализирующих данную реакцию пока отсутствует. Гомокарнозин (0,3-1,5 мМ [199]) синтезируется в мозге из ГАМК и L-гистидина с помощью карнозин-синтетазы. Однако скорость синтеза гомокарнозина при прочих равных условиях гораздо медленнее, чем для карнозина [5, 7]. Синтез анзерина (до 40 мМ в мышцах птиц [200]) происходит в мышцах позвоночных животных путем метилирования карнозина с помощью метилтрансферазы [201]. Анзерин не обнаружен в организме человека. Расщепление производных карнозина осуществляет сывороточная карнозиназа (CN1), при этом скорость гидролиза гомокарнозина составляет 11% от скорости гидролиза карнозина или анзерина [202].
Рисунок 1.5. Структура карнозина и его производных. Из [203] изменениями.
В организме человека карнозин выполняет множество функций, среди которых: pH-буфер в мышцах [10], хелатор металлов переменной валентности (Fe, Cu, Zn, Co) [11-13, 204, 205], нейротрансмиттер в обонятельных луковицах [2, 6], антиоксидант [15-18, 206, 207], ингибитор опухолевого роста [20, 21, 23, 208-210].
1.3.2. Антиоксидантные свойства карнозина и его производных
Карнозин эффективно препятствовал окислению 2,5-бис(гидроксиметил)фурана (BHMF) и N,N-диметил-4-нитрозоанилин (RNO) под действием света в растворе, содержащем фотосенсибилизатор [211, 212]. BHMF и RNO представляют собой ловушки синглетного кислорода (1О2), ингибирование окисления ловушек с помощью карнозина указывает на способность карнозина взаимодействовать с 1О2. Кроме того, карнозин снижал интенсивность хемилюминесценции, индуцируемой синглетным кислородом, образующимся в смеси Н2О2+NaClO, подтверждая способность тушить 1О2 [213]. Интересно отметить, что при эквимолярных концентрациях эффективность тушения 1О2 карнозином была выше, чем у гистидина, известной ловушки для 1О2 [211, 212, 214]. Более высокая эффективность карнозина по сравнению с гистидином, возможно, связана с особенностями внутримолекулярных взаимодействий (влияние β-аланина), что приводит к большей реакционной способности гистидина в молекуле карнозина.
Методом синхронной регистрации светопоглощения при радиолизе водного раствора карнозина было выявлено образование комплекса между супероксидом и карнозином с частичным переносом заряда. Образование комплекса приводило к снижению константы скорости дисмутации О2-• и повышению его стабильности в водном растворе [14]. Способность карнозина взаимодействовать с супероксид анионом была подтверждена в независимой работе Klebanov et al, где карнозин препятствовал восстановлению нитро-голубого тетразолия под действием О2-• образованного в смеси ксантин+ксантиноксидаза [17]. Сравнение эффективности тушения О2-•, образующегося в смеси глутатион+пероксидаза+люминол, выявило, что карнозин и гистидин демонстрировали примерно одинаковую эффективность, в то время как β-аланин был неактивен, что указывает на определяющую роль гистидина при взаимодействии карнозина с супероксидом [215].
С помощью метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) было продемонстрировано, что добавление карнозина к смеси реакции Фентона приводит к формированию продукта способного конкурировать со спиновой ловушкой для OH• - 5,5-диметилпирролин-N-оксидом (DMPO) [16, 216]. Гистидин и гомокарнозин взаимодействовали с OH• менее эффективно, чем карнозин. Образование комплексов OH• с β-аланином и ГАМК обнаружено не было. Интересно отметить, что эффективность связывания OH• в смеси β-аланин+гистидин была ниже, чем в присутствии карнозина, что еще раз подтверждает важную роль внутримолекулярных взаимодействий для антиоксидантного эффекта карнозина [16].
В ряде работ были продемонстрированы способности карнозина взаимодействовать с продуктами ПОЛ, препятствуя распространению окислительного повреждения. Карнозин сдерживал накопление малонового альдегида, образующегося в результате окисления фрагментов саркоплазматического ретикулума, и способствовал сохранению функций мембран [18]. Карнозин также снижал количество пероксильных радикалов, образующихся в липосомах печени в результате инициации ПОЛ с помощью азосоединений [15]. С использованием внеклеточных систем Zhou и Decker наглядно продемонстрировали взаимодействие карнозина с ненасыщенными альдегидами (транс-2-гексеналь, транс-2-ноненаль), а также 4-гидроксиноненалем – опасным продуктом повреждающим ДНК [19, 217]. Гистидин и имидазол также демонстрировали защитное действие, в то время как β-аланин и ГАМК не оказывали какого либо эффекта [15, 19].
Одним из проявлений антиоксидантных свойств карнозина является его радиомодифицирующий эффект. Повреждающее действие ионизирующего излучения связано, главным образом, с развитием мощнейшего окислительного стресса в результате радиолиза воды. Пероральное введение мышам карнозина в течение 20 суток перед облучением способствовало повышению выживаемости животных [218]. Радиомодифицирующее действие карнозина было подтверждено с помощью метода эндогенных селезеночных колоний. Было обнаружено увеличение эффективности образования колоний гематопоэтическими стволовыми клетками из костного мозга мышей, которым перед облучением вводили карнозин, по сравнению с контрольными животными [219, 220].
1.3.3. Эффект карнозина и его производных на пролиферацию нормальных и опухолевых клеток
Продолжительное культивирование нормальных человеческих фибробластов с карнозином (10 - 50 мМ) приводило к удлинению продолжительности жизни клеток, что выражалось в увеличении количества популяционных удвоений, т.н. предела Хейфлика [221]. Кроме того, отмечали задержку развития старческого фенотипа в виде усиления зернистости и потери вытянутой фибробластоподобной формы [22]. Добавление карнозина к клеткам долгое время культивируемым на среде без карнозина приводило к обращению старческого фенотипа и способствовало увеличению продолжительности их жизни в сравнении с контролем. Удаление карнозина из среды нивелировало описанный эффект [222]. Карнозин также способствовал увеличению эффективности посева фибробластов. При посеве клеток в низких разведениях, в чашках инкубируемых с карнозином образовывалось больше колоний, чем в контрольных, что указывает на активацию пролиферативных процессов фибробластов под действием карнозина [222]. Позже Shao et al. продемонстрировали замедление скорости укорачивания теломер и снижение количества дефектов в ДНК теломер под действием карнозина [223]. Укорачивание теломер представляется одним из основных факторов ограничивающий количество клеточных делений [224], замедление этого процесса может быть одним из механизмов удлинения предела Хейфлика и задержки формирования старческого фенотипа с помощью карнозина.
В 1986 году, японские ученые Nagai и Suda впервые описали эффект карнозина на опухолевый клетки, который в корне отличался от действия карнозина на нормальные клетки. Подкожные инъекции карнозина мышам линии ddY, которым предварительно вживляли клетки саркомы, способствовали снижению интенсивности пролиферации опухолевых клеток и увеличивали выживаемость животных [20]. В независимом исследовании Renner et al. на мышах с ксенографами HER2/neu NIH3T3 фибробластов показали, что ежедневные внутрибрюшинные инъекции карнозина существенно подавляют пролиферацию злокачественных клеток и опухолевый рост. Снижение скорости пролиферации опухолевых клеток под действием карнозина сопровождалось снижением синтеза АФК и активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Кроме того, в опухолях мышей, которым делали инъекции карнозина карнозина было обнаружено меньшее количество митозов, чем у контрольных животных [21]. Сходные изменения наблюдали в первичной культуре клеток мультиформной глиобластомы (Glioblastoma multiforme). Обработка клеток карнозином (20-50 мМ) в течение 4 дней приводила к уменьшению внутриклеточного уровня АТФ и ЛДГ, а также к снижению синтеза ДНК [208]. Ингибирование митохондриального дыхания с помощью KCN в клетках обработанных карнозином не влияло на выработку АТФ или выживаемость клеток. Обработка клеток глиобластомы оксаматом – ингибитором ЛДГ – приводила к резкому снижению концентрации АТФ, при этом карнозин приводил к дальнейшему снижению концентрации АТФ. Исходя из полученных данных авторами был сделан вывод о том, что карнозин индуцирует изменения на уровне гликолиза, которые приводят к ингибированию клеточной пролиферации [225]. Holliday и McFarland наглядно продемонстрировали избирательность ингибирующего эффекта карнозина на рост опухолевых клеток [23, 226]. Добавление карнозина к смеси опухолевых клеток (HeLa) и нормальных человеческих фибробластов (MRC-5) приводило к выборочному уничтожению опухолевых HeLa клеток и способствовало удлинению продолжительности жизни фибробластов [23]. Интересно отметить, что действие карнозина на две активно пролиферирующие культуры – эмбриональные стволовые (ЭС) клетки мыши и иммортальные клетки эмбриональной терато-карциномы (ЭК) мыши также было различно. Карнозин препятствовал росту злокачественных ЭК-клеток, не затрагивая роста ЭС-клеток [226]. Полученные данные указывали на то, что ни степень дифференцировки, ни скорость пролиферации клеток не являются определяющими факторами избирательного действия карнозина на опухолевые клетки.
Количественный анализ экспрессии белков в клетках глиобластомы в контроле и после обработки карнозином выявил изменения в экспрессии 31 белка под действием карнозина, в том числе: Von Hippel–Lindau binding protein 1 (VBP1), BCL2-associated athanogene 2 (BAG2), GrpE-like protein chaperone (GrpEL), transaldolase 1 (TALDO), uroporphyrinogen decarboxylase (UROD) и Obg-like ATPase 1 (OLA1) [227]. Интересно отметить, что VBP1, BAG2 и GrpEL участвуют в регуляции активности Hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) [227-230], а BAG2 и GrpEL вовлечены в регуляцию активности белков теплового шока (Heat shock protein 70, Hsp70) [231]. Оверэкспрессия HIF-1α и Hsp70 часто способствует злокачественной трансформации [232, 233]. Приведенные данные указывают на возможное участие регуляторных каскадов HIF-1α и Hsp70 в антипролиферативном эффекте карнозина.
В нашей лаборатории было показано, что карнозин замедляет рост уровня фосфо-ERK1/2 и JNK в гранулярных клетках мозжечка в условиях окислительного стресса, индуцированного активацией глутаматных рецепторов [234]. Как было отмечено выше ERK1/2 представляет собой редокс-чувствительную МАР-киназу, регулирующую множество внутриклеточных функций, в том числе и пролиферативные процессы. Было показано, что ингибирование образования Н2О2 препятствует активации ERK1/2 и развитию пролиферативного ответа [235]. Таким образом, понижение уровня АФК под действием карнозина представляется одним из механизмов подавления активации ЕRK1/2 [234, 236]. Повышенный уровень ERK1/2 часто встречается при онкологических заболеваниях [105]. Ингибирование роста ERK1/2 может быть одним из механизмов антипролиферативного эффекта карнозина.
Исследование противоопухолевого эффекта производных карнозина (анзерина, гомокарнозина и D-карнозина) выявило, что только анзерин способен ингибировать рост трансформированных клеток. Также было обнаружено, при равных концентрациях (20 мМ) β-аланин не оказывал какого либо влияния на опухолевые клетки, в то время как гистидин убивал все клетки (нормальные и опухолевые) [23]. Полученные данные явно указывают на определяющую роль гистидина в проявлении противоопухолевого эффекта карнозина.
1.3.4. Пинеалон. Общая характеристика и свойства
В настоящее время установлена роль регуляторных короткоцепочечных пептидов в формировании адаптационного ответа организма на стресс и нарушения гомеостаза [237]. Будучи эндогенными компонентами живой клетки, пептидные биорегуляторы обладают разнообразным биологическим действием, они эффективны в низких дозах, не вызывают побочных эффектов [238]. Однако их терапевтическое применение ограничено проницаемостью через гемато-энцефалический барьер (ГЭБ) и относительно быстрой скоростью распада. Преодолеть эти проблемы можно путем синтеза короткоцепочечных аналогов нейропептидов, сохраняющих их специфическую активность [239-243].
Пинеалон представляет собой синтетический трипептид состоящий из трех аминокислот глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и аргинина (Glu-Asp-Arg), синтезированный на основе анализа экстракта коры головного мозга крупного рогатого скота (Рис. 1.6). Последовательность Glu-Asp-Arg была выбрана как наиболее часто встречающаяся в "активных участках" наиболее функционально-значимых в своей группе полипептидов, содержащихся в животных экстрактах.
Пинеалон демонстрирует эффективные антиоксидантные свойства. Пинеалон усиливал устойчивость экспериментальных животных к пренатальной и острой сублетальной гипобарической гипоксии. Введение пинеалона крысам чувствительным к гипоксии усиливало активность антиоксидантных ферментов – СОД и GPx. В культуре гранулярных клеток мозжечка пинеалон снижал уровень АФК и клеточную гибель, индуцированные активацией глутаматных рецепторов NMDA-класса [244, 245]. На модели пренатальной гипергомоцистеинемии было показано, что инъекции пинеалона самкам улучшают когнитивные способности потомства и способствуют развитию устойчивости к окислительному стрессу [246]. Кроме того, пинеалон препятствовал увеличению уровня АФК в гранулярных клетках мозжечка крысы под действием гомоцистеина (ГЦ) и затормаживал активацию ERK1/2 [247]. Недавно были получены данные о возможном участии пинеалона в эпигенетической регуляции. Пинеалон проникал в ядро клетки, а также взаимодействовал с некоторыми промоторными последовательностями, в частности с одноцепочечной oligo(dGC). Интересно, что предпочтительным местом связывания пинеалона была последовательность CNG, которая также является местом метилирования ДНК [248, 249]. Исходя из способностей пинеалона модулировать внутриклеточный уровень АФК и связываться с ДНК можно предположить, что пинеалон также способен участвовать в регуляции пролиферации.
Рисунок 1.6. Химическая структура молекулы пинеалона.
Подводя итог всему выше сказанному, можно заключить, что антипролиферативный эффект карнозина известен давно, однако его молекулярный механизм до сих пор непонятен. Понимание механизма действия карнозина помогло бы расширить область применения природного дипептида карнозин на практике, например в терапии опухолевых заболеваний. На сегодняшний день накоплено множество сведений об участии про- и антиоксидантов в регуляции процессов клеточной пролиферации. Поскольку, карнозин демонстрирует эффективные антиоксидантные свойства, было сделано предположение о том, что ингибирующий эффект карнозина на пролиферацию опухолевых клеток является следствием его антиоксидантной активности. Сравнительный анализ действия карнозина и его производных на пролиферацию опухолевых клеток помог бы определить функциональную нагрузку отдельных частей молекулы при антипролиферативном эффекте и пути улучшения эффективности антипролиферативных свойств карнозина.
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Культуры клеток
В работе были использованы следующие клеточные линии: феохромоцитома крысы (РС-12); карцинома горла и рта (FaDu, Cal27) и молочной железы (MB231) человека; глиобластома человека (U-118-MG). Клетки PC-12 культивировали в среде RPMI 1640 с 25 мМ HEPES и 24 мМ бикарбоната натрия (ПанЭко, Россия), с добавлением 2 мМ глутамина (ПанЭко, Россия), 20 мкг/мл гентамицина (ПанЭко, Россия) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ПанЭко, Россия). Клетки FaDu и Cal27 культивировали в среде DMEM (Gibco, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США) и 100 ед/мл ПенСтреп (Gibco, США). Клетки MB231 инкубировали в среде RPMI 1640 (Gibco, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США) и 100 ед/мл ПенСтреп (Gibco, США). Клетки U-118-MG культивировали в смеси DMEM:F12 (1:1) (Gibco, США) с добавлением 15 мМ HEPES (Gibco, США), 1 мМ пирувата натрия (Gibco, США), 10 мкг/мл инсулина (Sigma Aldrich, США), 5 нг/мл фактора роста фибробластов (Sigma Aldrich, США), 15% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США) и 100 ед/мл ПенСтреп (Gibco, США). Клетки содержали в СО2-инкубаторе (ShelLab, США) в присутствии 5% СО2, 98% влажности и 37˚С.
2.2. Исследуемые соединения
Карнозин (чистота 99%) был любезно предоставлен «Hamari Chem., Ltd», Осака, Япония. Гомокарнозин (чистота 99%) и анзерин (чистота 99%) были приобретены, соответственно, в «Hamari Chem., Ltd» и «Yaizu Suisankagaku Industry Co.,Ltd.» (чистота 99%). N-ацетилкарнозин был синтезирован рутинным путем в Лаборатории клинической и экспериментальной нейрохимии ФГБУ «НЦН» РАМН (чистота 98,7%, определена с помощью HPLC). L-гистидин-β-аланин был синтезирован рутинным путем в Исследовательском Институте Химического Разнообразия (чистота 98%, определена с помощью HPLC). Пинеалон был предоставлен Научно-производственным центром ревитализации и здоровья.
2.3. Исследование клеточной пролиферации
2.3.1. Время удвоения популяции
Время удвоения популяции (Тd) – это период времени, за который происходит увеличение количества клеток в два раза. Для вычисления Тd клетки высаживали в чашки Петри в небольших разведениях. Каждые два дня клетки снимали с помощью трипсина (Gibco, США), считали их количество с помощью Z1 Coulter Counter (Beckman Coulter, США) и строили кривые роста (Рис. 2.1). Время удвоения популяции (Тd) рассчитывали на экспоненциальном участке роста по формуле:
Тd=0.693t/ln(Nt/N0),
где t – время (дни), N0 – начальное количество клеток, Nt – количество клеток ко дню t. Nt вычисляли по уравнению экспоненциальной линии тренда (Рис. 2.1).
Рисунок 2.1. Пример кривой роста с экспоненциальной линией тренда и уравнением линии тренда для вычисления времени удвоения популяции. x – время (д), y – количество клеток ко дню х.
2.3.2. Эффективность посева и выживаемость клеток
Выживаемость клеток определяли по их способности формировать колонии. Клетки рассеивали в низких разведениях в 60 мм чашки Петри, по истечении 10 дней клетки фиксировали 2-4 мин в 70% этаноле, разведенном на фосфатном буфере, окрашивали 10 мин с помощью раствора содержащего 0.05% бриллиантового синего G-250, 50% метанола, 5% уксусной кислоты, 45% воды. Далее подсчитывали количество колоний состоящих из 50 и более клеток и вычисляли процент клеток образовавших колонии, эффективность посева (ЭП), по формуле:
ЭП = (количество колоний/количество посаженных клеток) х 100.
Выживаемость рассчитывали как процентное соотношение ЭП в клетках, обработанных карнозином или подвергнутых действию ионизирующего излучения, к ЭП клеток в контроле.
2.4. Проточная цитометрия
В данной работе все измерения проводили на проточном цитометре FACSCalibur (BD, США), оснащенном ионным аргоновым лазером с длинной волны 488 нм и двумя светофильтрами: 585/42 нм для красной флуоресценции (PI) и 530/30 нм для зеленой флуоресценции (ФИТЦ, DCF).
2.4.1. Измерение уровня АФК
Уровень внутриклеточных АФК измеряли с помощью флуоресцентного красителя 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин-диацетата (DCFН2-DA) (Рис. 2.2).
Рисунок 2.2. Реакция превращения DCFH2-DA в DCF (из [250] с изменениями). См. пояснения в тексте.
DCFН2-DA представляет собой липофильное соединение, легко проникающее через мембрану живых клеток. Внутриклеточные эстеразы отщепляют ацетильные группы от DCFН2-DA, превращая его в 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин (DCFН2), для которого мембрана живой клетки уже непроницаема. Под действием внутриклеточных АФК (в основном Н2О2) происходит окисление DCFН2 с образованием флуоресцирующего продукта 2,7-дихлорфлуоресцеина (DCF, λex=504 нм, λem=529) [250]. Для измерения уровня АФК клетки инкубировали с 100 мкМ DCFН2-DA (Biotium, США) в течение 30 мин в темноте (37оС) и затем анализировали на проточном цитометре. Данные обрабатывали в программе CellQuest Pro (BD, США) и рассчитывали среднее значение интенсивности флуоресценции.
2.4.2. Определение доли мертвых клеток
Долю мертвых клеток определяли по интенсивности свечения флуоресцентного красителя йодида пропидия (PI) (Рис. 2.3.А). PI количественно связывается нуклеиновыми кислотами путем интеркаляции между основаниями двойной цепи ДНК или РНК в соотношении: 1 молекула красителя на 4-5 пар оснований [251, 252]. После связывания с нуклеиновой кислотой флуоресценция PI усиливается в 20 - 30 раз и максимум испускания смещается на 15 нм в УФ-сторону (максимум поглощения (λex) 535 нм, максимум испускания (λem) – 617 нм) [253].
Рисунок 2.3. Флуоресцентные красители использованные в работе. (А) Йодид пропидия (PI). (Б) 5-бромдезоксиуридин (БДУ).
Для определения доли мертвых клеток клетки инкубировали с 1 мкМ PI (Invitrogen, Germany) в течение 3 мин в темноте при комнатной температуре (tкомн) и затем анализировали на проточном цитометре. Данные обрабатывали в программе Cell Quest Pro (BD, США) и рассчитывали среднее значение интенсивности флуоресценции в Microsoft Exel (Microsoft, США).
2.4.3. Анализ клеточного цикла
Распределение клеток по фазам клеточного цикла измеряли по интенсивности свечения PI (Рис. 2.3.А). PI связывается с ДНК пропорционально его количеству, то есть, чем выше содержание ДНК, тем интенсивнее флуоресценция PI. Количество ДНК в разных фазах клеточного цикла неодинаково. G0 и G1 фазы характеризуются диплоидным набором хромосом – 2n, где n – это количество хромосом, а 2 обозначает, что каждая хромосома содержит только две хроматиды. Во время S фазы происходит удвоение хроматид в каждой хромосоме, которое завершается к началу G2 фазы, поэтому набор хромосом клеток в G2 фазе составляет 4n. Клетки, содержащие >2n, но <4n хромосом, относятся к S фазе (Рис. 2.4). Иногда G1 пику предшествует sub-G1 пик, который отражает количество апоптотических клеток. Фрагментация ДНК под действием эндонуклеаз при апоптозе приводит к образованию большого количества коротких ДНК фрагментов. Часть ДНК фрагментов теряется при подготовке проб, приводя к снижению внутриклеточного количества ДНК, которое в апоптотических клетках составляет <2n, что отражается в появлении sub-G1 пика.
Рисунок 2.4. Пример анализа клеточного цикла согласно содержанию ДНК. См. пояснения в тексте.
Для анализа клеточного цикла клетки фиксировали в 70% этаноле в течение 12 ч при - 4оС. Фиксированные клетки отмывали от этанола и инкубировали 30 мин с 1 мг/мл РНКазы (Invitrogen, Германия), затем 60 мин с 35 мкг/мл PI (Invitrogen, Германия) в темноте при tкомн. Данные обрабатывали с помощью программы ModFit LTTM (BD, США).
2.4.4. Двухпараметрический анализ клеточного цикла
Для двухпараметрического анализа клеточного цикла был использован маркер клеток в S фазе – 5-бромдезоксиуридин (БДУ) (Рис. 2.3.Б) [170, 254]. БДУ представляет собой аналог нуклеотида тимидина и включается в ДНК во время репликации, то есть в S фазе. Клетки инкубировали 30 мин с 5-бромдезоксиуридином (БДУ) (37оС) и фиксировали в 70% этаноле в течение 12 ч при - 4оС. Фиксированные клетки инкубировали 30 мин в 0.4 мг/мл пепсина, приготовленном на 2 N HCl, и нейтрализовали в 0.1 M боратном буфере. Пробы центрифугировали (1500 об/мин, 5 мин при 4оС), осадок инкубировали 1 ч с мышиными антителами к БДУ (1:10, BD, США) и 1 ч с антимышиными козьими флуоресцеин изотиоцианат (ФИТЦ)-коньюгированными антителами (1:10, BD, США). Далее клетки инкубировали с РНКазой и PI (см. предыдущий пункт). Данные обрабатывали в программе FlowJo v8.8.7.
2.5. Иммуноблоттинг
Для выделения белков клетки разрушали с помощью ультразвука в лизирующем буфере, содержащем фосфатный буфер (pH 7.8,) ингибитор фосфатаз (PhosSTOP, Roche, США), коктейль ингибиторов протеаз (Sigma, США), 2% NP-40 и ДНКазу (0,01 ед/мкл, Zimo Research Corp., США). Лизаты центрифугировали, для Иммуноблоттинга использовали супернатант.
Белки разделяли в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по Леммли [255] и переносили с помощью полусухого электротранспорта на нитроцеллюлозную мембрану (BioRad, США). Места неспецифического связывания 1 ч блокировали в 5% молоке. Мембраны инкубировали с антителами против MnСОД (1:1000, Millipore, США), циклина B1 (1:1000, BD, США), НАДФН (1:500, BD, США) и актина (1:1000, Millipore, США). В качестве вторичных антител были использованы: меченные пероксидазой хрена антимышиные овечьи антитела (1:5000, GE Healthcare, США) и антикроличьи ослиные антитела (1:10,000, GE Healthcare, США). Иммунореактивные полоски визуализировали с помощью набора Pierce ECL 2 Western Blotting Substrate (Thermo Scientific, США) согласно инструкции разработчика и детектировали хемилюминисценцию с помощью Typhoon FLA 7000 (General Electric, США). Насыщенность полос анализировали в программе ImageJ (NIH, США). Уровень актина и НАДФН использовали для коррекции загрузки белка.
2.6. Определение активности MnСОД
Белки выделяли по методу, описанному в предыдущем разделе (2.5), и разделяли с помощью электрофореза в 12,5% полиакриламидном геле без додецилсульфата по методу предложенному Weydert et al. [66, 256]. Гель инкубировали 20 мин при tкомн в окрашивающей смеси, содержащей 2,43 мМ нитросиний тетразолий, 2,8×10−5 M рибофлавин и 28 мМ ТЕМЕД, и проявляли на свету до появления прозрачных полос. Метод основан на том, что на свету рибофлавин образует супероксид, который превращает нитросиний тетразолий из желтого в темно синий, что окрашивает гель. Поскольку MnСОД катализирует реакцию дисмутации супероксида, то MnСОД-содержащие полоски становятся прозрачными. Проявленный гель сканировали с помощью Epson Perfection 4990 PHOTO (Epson, США) и анализировали насыщенность полос в программе ImageJ (NIH, США).
2.7. Определение активности каталазы
Белок выделяли по методу, описанному выше (Раздел 2.5). Активность каталазы определяли биохимическим путем на спектрофотометре по скорости деградации пероксида водорода по методу, предложенному Aebi и соавторами [257]. Принцип метода основан на том, что активность каталазы рассчитывается исходя из скорости распада Н2О2. В кювете смешивали известные количества образца и Н2О2 и измеряли оптическую плотность при 240 нМ. Поскольку каталаза разрушает Н2О2, то чем выше была активность каталазы в образце, тем быстрее снижалась концентрация Н2О2 в кювете.
2.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени
Клетки лизировали в тризоле и затем выделяли РНК с помощью набора «Direct-zolTM RNA MiniPrep Kit» согласно инструкции производителя (Zimo Research Corp., США). Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали с помощью набора «High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit» (Applied Biosystems, США). Количественную ПЦР в режиме реального времени (45 циклов) проводили на приборе StepOne™ System (Applied Biosystems, США) с использованием красителя SYBR Green и праймеров. Последовательности праймеров представленных в Таблице 1. Данные анализировали в программе StepOne™ Software v2.2 (Applied Biosystems, США) и Microsoft Excel (Microsoft, США). Результаты представлены в виде относительных значений экспрессии (2−ΔΔCt), где Ct - значение порогового цикла реакции.
2.9. Статистическая обработка результатов
Результаты измерений, проведенных в 3-5 параллельных пробах, представлены в виде «среднее значение ± стандартное отклонение». Статистическая значимость определяли с помощью одномерного дисперсионного анализа с последующим тестом на наименьшую значимую разность и тестом на взвешенное среднее Тьюки. Данные тесты используются для сравнения и определения разницы между и в пределах групп данных в зависимости от значений среднего и среднеквадратических ошибок для каждой переменной. Гомогенность дисперсии бралась в пределах доверительного интервала в 95%. Результаты со значениями P<0.05 принимались как статистически значимые.
Таблица 1. Последовательности праймеров для ПЦР в реальном времени.
Ген
|
Gene Bank No.
|
Последовательность (5’ 3’)
|
Размер ампликона (п.о.)
|
CCNB1
(циклин В1)
|
NM_031966.3
|
Forward: TAGCACTGAAAATTCTGGATAATGGTGA
Reverse: TTGATTTACCATGACTACATTCTTAGCCAG
|
125
|
ACTB
(актин В)
|
NM_001101.3
|
Forward:
TCACCATTGGCAATGAGCGGTT
Reverse:
AGTTTCGTGGATGCCACAGGACT
|
89
|
CRNS1
(карнозин-синтетаза)
|
NM_001166222.1
|
Forward:
AAGCTGGAGGAGGAGGAGAGTGTC
Reverse:
CCTTGCTCAGCAGTGGCCTATCA
|
154
|
CNDP1
(карнозиназа)
|
NM_032649
|
Forward:
CAGCAATCACTTACGGAACCCG
Resverse:
CCGAGAAGAGCAACCAGATCAGC
|
133
|
MnСОД
|
NM_000636.2
|
Forward:
TTGGCCAAGGGAGATGTTAC
Reverse:
AGTCACGTTTGATGGCTTCC
|
157
|
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
|
