Клинико-биохимические и иммунологические особенности развития легочной гипертензии при врожденных пороках сердца у детей раннего возраста
Скачать 378.39 Kb.
|
Анализ экспрессии мРНК цитокинов IL-1, IL-6, TNF-α и индуцибельной NO-синтазы в лимфоцитарно-моноцитарной фракции крови методом обратной транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР)Для анализа экспрессии проводили забор 1 мл венозной крови. Мононуклеарные клетки и лимфоциты периферической крови выделяли непосредственно после ее забора центрифугированием (при 24ºС и 1500 g в течение 15 мин) в градиенте плотности Ficoll-Paque (1,077 г/см3), в качестве антикоагулянта использовали ЭДТА. Отбирали обогащенную лимфоцитами и моноцитами интерфазу, добавляли эквиобъем тканевой среды RPMI и осаждали клетки центрифугированием в течение 15 минут при температуре 24ºС и 400 g. Выделение РНК. Выделение РНК проводили с помощью фенольно-хлороформного метода с использованием TRI-реагента (Sigma). После гомогенизации при добавлении 500 мкл TRI-реагента, образцы перемешивали с 150 мкл хлороформа и проводили разделение фаз центрифугированием (12000 g в течение 20 минут при 4С). РНК из водной фазы осаждали добавлением эквиобъема изопропилового спирта и последующим центрифугированием при 14000 g в течение 30 минут при 4С. Осадок РНК промывали дважды 75%-ным этанолом и растворяли в 25 мкл деионизованной воды, обработанной диэтилпирокарбонатом и содержащей 2 ед. активности ингибитора РНКаз (Sintol). Относительную концентрацию РНК оценивали электрофоретически. Проведение ДНК-азной обработки РНК. Для удаления примеси ДНК образцы, содержащие 1-2 мкг РНК и 1 единицу активности ингибитора РНКазы, инкубировали в течение 40 минут при 37С с 2 единицами активности ДНКазы I, не обладающей РНКазной активностью (Fermentas). После инкубации инактивировали ДНКазу стоп-реагентом (Fermentas). Качество ДНК-азной обработки отслеживали по результатам ПЦР для -актина. Проведение обратной транскрипции (ОТ) мРНК. Обратную транскрипцию проводили в течение 1,5 часов при 38С в образцах, содержащих на 0,5-1 мкг обработанной ДНКазой РНК 100 единиц активности обратной транскриптазы MMuLV (Fermentas), 1 единицу активности ингибитора РНКазы, 0,1 мкг олиго(18)-dТ праймеров (Sintol), 60 моль гексарандом праймеров (Sintol), 400 мкМ дезоксинуклеотидилтрифосфатов (Sigma). Проведение полимеразной цепной реакции. В пробирки с кДНК вносили 0,13 мМ дезоксинуклеотидилтрифосфатов, 4 pмоль специфичных праймеров и 0,5 единицы активности Taq-полимеразы (Fermentas) в 1-кратном буфере для ПЦР. Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием амплификатора “Терцик” (“ДНК-технология”, Россия) в течение 39 (для -актина) или 42 циклов (IL-1, IL-6, TNF-) при параметрах: 95С – 15 секунд, 60С (для -актина, IL-1, TNF-) или 62С (для IL-6) – 20 секунд, 72С – 30 секунд. Были использованы следующие пары праймеров: для -актина - 5’-AGGCCAACCGCGAGAAGATGAC, 5’-TCGGCCGTGGTGGTGAAGC, для IL-1 - 5'-CTCCTCACCCACACCATCAGCCGC, 5'-GAAGGTTGGATGTTCGTCCTCCACT, для TNF- - 5'-CAGAGAGTCCTGTGCTGAATGTGGA, 5'-AGAGGAGGGTTTCTTAGAACCAA, для IL-6 - 5'-GATTCCAAAGATGTAGCCGCCCCACA, 5'-CATTTGTGGTTGGGTCAGGGGTGGT, для iNOS - 5'-GGCTCCTTCAAAGAGGCAAAAATAGA, 5'-AGTAATGGCCGACCTGATGTTGC. Результаты ПЦР анализировали электрофоретически, используя 2%-ный агарозный гель. Производилась фотосъемка геля в ультрафиолете на цифровую камеру «Kodak DC 290 Zoom», с обработкой полученного изображения программой «KODAK 1D Image Analysis Software» («Kodak», США). Результатом явилась относительная яркость полос ампликонов, выраженная в условных единицах, сравниваемая с яркостью продуктов ПЦР положительного контроля (кДНК стимулированных лимфоцитов). Количественный анализ проводили на основании калибровочных кривых, полученных по результатам амплификации растворов контрольной кДНК после последовательных 10-ти кратных разведений. Определение активности антиоксидантной системы Измерение каталазной активности сыворотки крови проводили при помощи спектрофотометрии. При длине волны 240 нм регистрировали истощение Н2О2 в пробе, содержащей 50 мкл сыворотки на 2 мл инкубационной смеси (50 мМ РВS, рН=7,4, Н2О2 10 мМ) за 1 мин., из чего рассчитывали максимальную активность каталазы на мл сыворотки. Измерение содержания общего глутатиона в плазме крови проводили спектрофотометрически при длине волны 412 нм. К 1 мл 50 мМ калий-фосфатного буфера, рН=7,5, добавляли 150 мкл депротеинизированной плазмы. Реакцию начинали добавлением DTNB (до концентрации 200 мкМ). Для восстановления окисленного глутатиона использовали глутатион-редуктазу в концентрации 0,5 Ед/мл, что требовало внесения NADPH (до 100 мкМ). Концентрацию глутатиона определяли после 1 мин. инкубации по калибровочной шкале. Измерение АОА сыворотки крови осуществлялось методом фотохемилюминесценции (ФХЛ). К раствору, содержащему 1500 мкл бидистиллята, 1000 мкл карбонатного буфера (0.1 М, рН=10,4) и 10 мкл люминола (1мМ, pH=7,83), добавляли по 10 мкл сыворотки. Число измерений каждого образца было равно трем. Результаты измерения АОА водорастворимых антиоксидантов представлялись в эквивалентных единицах концентрации аскорбиновой кислоты путем сравнения полученных данных АОА с экспериментальными данными градуировочной кривой для аскорбиновой кислоты в диапазоне концентраций от 10 до 400 мкМ. Для определения содержания нитритов и нитратов в сыворотке крови производили депротеинизацию сыворотки путем добавления в пробу этанола в соотношении 1:2. С целью восстановления нитратов до нитритов использовали раствор VCl3. Для определения концентрации нитритов использовали реакцию Грисса. После инкубации в течение 60 мин. при t=37 C измеряли оптическую плотность при длине волны 492 нм. Содержание нитратов/нитритов вычисляли по калибровочной шкале. Статистическая обработка данных Полученные результаты обрабатывались с помощью пакета программ SPSS 15.0. Данные представлены в виде медианы с указанием минимального и максимального значений либо среднего (M) ± стандартная ошибка среднего (SD). Оценка различий между группами проводилась при помощи непараметрических методов. Степень связи между признаками оценивали, вычисляя коэффициент ранговой корреляции Спирмена (k). Значения р<0,05 считали значимыми. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В нашей работе было обследовано 39 пациентов с ВПС и лево-правым шунтом, следствием чего является развитие гиперволемической легочной гипертензии. 13 пациентов с синдромом Дауна и ВПС были выделены в отдельную группу т.к. известно, что у них легочная гипертензия прогрессирует быстрее. В группах детей с ВПС родители предъявляли жалобы на одышку, утомляемость при кормлении и другой физической нагрузке, недостаточную прибавку массы тела, задержку психомоторного развития. При антропометрии была обнаружена гипотрофия у 13 из 26 детей (50%) в основной группе, из них у 9 пациентов - гипотрофия II-III степени. Особенностью пациентов с синдромом Дауна было наличие дефицита массы тела у всех 13 пациентов с ВПС, 10 из которых имели гипотрофию II-III степени. Пациенты контрольной группы поступали в стационар для обследования по поводу шума в сердце. У них были диагностированы анатомические особенности, не влияющие на системную и легочную гемодинамику - дополнительные трабекулы или хорды левого желудочка, ООО, пролапс митрального клапана с минимальной регургитацией. Симптомов сердечной недостаточности у детей контрольной группы обнаружено не было. Систолическое давление в ПЖ составило не более 30 мм рт. ст.. Среди сопутствующей патологии у детей как основной, так и групп сравнения встречались следующие заболевания: функциональные нарушения желудочно-кишечного тракта, дисбиоз кишечника, анемия, рахит, атопический дерматит, пахово-мошоночная грыжа, дисплазия тазобедренных суставов, последствия перинатального поражение ЦНС гипоксически-ишемического генеза в виде гидроцефального синдрома, синдрома повышенной нервно-рефлекторной возбудимости, синдрома мышечной дистонии, гипотонии, задержки психомоторного развития. Кардиологическое обследование включало допплер-ЭхоКГ, рентгенографию грудной клетки, ЭКГ и определение сатурации крови кислородом. Врожденные пороки сердца, давление в ПЖ и возраст пациентов в каждой группе представлены в табл. 1. Среди ВПС в основной группе доминировал ДМЖП – у 19 из 26 пациентов, который по частоте встречаемости в популяции в целом занимает 1-е место. У детей с синдромом Дауна наиболее часто встречался ООАВК (у 5 из 13 пациентов) – «типичный» ВПС для этого синдрома. Наличие порока сердца с лево-правым шунтом крови приводило к развитию клинических признаков недостаточности кровообращения (НК). Степень НК определяли по классификации Н.А. Белоконь (1987). Некоторые показатели инструментального обследования в образовавшихся группах приведены в табл. 2. Табл.2 Некоторые показатели кардиологического инструментального обследования.
Примечание. Данные представлены в виде среднего (M) ± стандартная ошибка среднего (SD). В скобках указаны минимальное и максимальное значения в каждой группе. СД – синдром Дауна, КТИ – кардиоторакальный индекс, SaO2 - сатурация крови О2. Основным эхокардиографичеким критерием, характеризующим степень легочной гипертензии, было систолическое давление в правом желудочке (ПЖ), которое определяли по градиенту регургитации на трикуспидальном клапане или по градиенту давления ЛЖ-ПЖ при наличии ДМЖП. У всех пациентов основной группы и группы «СД + ВПС» отмечался лево-правый сброс крови. При этом признаки легочной гипертензии (повышение систолического давления в ПЖ, расширение ЛА, увеличение правых отделов сердца) были обнаружены у 33 из 39 пациентов. Систолическое давление в ПЖ составило 17-130 мм рт.ст.. На рентгенограмме у пациентов с ВПС и лево-правым шунтом обнаруживали усиление сосудистого рисунка по артериальному типу, расширение и утрату структурности корней легких, признаки эмфиземы легких, кардиомегалию, выбухание дуги легочной артерии. В табл.2 продемонстрировано нарастание кардиоторакального индекса (КТИ) одновременно с нарастанием давления в ПЖ по мере утяжеления клинических симптомов сердечной недостаточности. Основными особенностями ЭКГ являлись признаки гипертрофии правого и/или левого желудочков, нагрузка на предсердия, нарушения проводимости в виде блокады правой ножки пучка Гиса, метаболические изменения миокарда желудочков. Нарушения сердечного ритма в виде редкой желудочковой экстрасистолии были зарегистрированы лишь у одного ребенка с ДМЖП и начальной ЛГ. Статистически значимые отличия в насыщении крови кислородом были обнаружены между пациентами с «ВПС и гиповолемией МКК» и контрольной группой - 85±8 и 96±2 % соответственно (p<0,05). Снижение сатурации у данных пациентов обусловлено наличием классических «синих» ВПС – ТФ, ДОС со СЛА - в этой группе. Статистические различия между другими группами по сравнению с контролем не найдены. Безусловно, все вышеперечисленные клинико-инструментальные особенности хорошо описаны и составляют «классический» симптомокомплекс легочной гипертензии при ВПС у детей раннего возраста. Основное внимание в нашей работе было уделено изучению роли антиоксидантных механизмов, системы оксида азота и иммунных провоспалительных факторов при данной патологии. 1. Провоспалительные факторы: экспрессия мРНК провоспалительных цитокинов в лимфоцитарно-моноцитарной фракции крови. В нашем исследовании планировалось определить, насколько рано при ВПС с обогащением МКК и формированием ЛГ в процесс вовлекаются провоспалительные цитокины (IL-1, IL-6, TNF-α), и сопоставить их уровень со степенью гемодинамических нарушений. Острые и хронические инфекционные заболевания были критерием исключения для всех групп. Их отсутствие было подтверждено по данным осмотра, клинических анализов крови и мочи, рентгенографии органов грудной клетки, отсутствия патогенной флоры в посеве из носа и зева, отрицательных результатов посева кала на микробы кишечной группы. У пациентов с ВПС и лево-правым шунтом было обнаружено увеличение экспрессии IL-1 и TNF-α в лимфоцитах по сравнению с контролем (табл.3, рис.1), и их уровни коррелировали между собой (k = 0,77, p<0,05). Примечательно, что у здоровых детей зависимость уровней экспрессии этих цитокинов между собой отсутствовала.  Рис.1 Экспрессия провоспалительных цитокинов в лимфоцитарно-моноцитарной фракции крови. СД – синдром Дауна, МКК – малый круг кровообращения. * р<0,05. Наши данные совпадают с литературными, в которых продемонстрирована активация провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, TNF-α, хемокинов) при ЛГ в более старших возрастных группах (Dorfmüller P., 2003, G.P., 2008). Провоспалительные цитокины синтезируются иммунными клетками в периферической крови и лимфоцитарно-моноцитарными бронховаскулярными инфильтратами в легких, а также эндотелиальными клетками. Предполагаются различные пути влияния провоспалительных факторов на легочное сосудистое русло. В культуре легочных артериальных гладкомышечных клеток показано увеличение экспрессии циклооксигеназы 2 типа под воздействием IL-1β, IL-6, TGF- β1, что приводит к гиперпродукции PgE2 – одного из основных легочных вазоконстрикторов – и угнетение синтеза простациклина (Bradbury 2002, Itoh A., 2003). Провоспалительные цитокины стимулируют образование свободных радикалов. Обнаружено негативное влияние IL-6 и TNF-α на количество и функции предшественников эндотелиальных клеток, которые мобилизуются из костного мозга и участвуют в постнатальном васкулогенезе (Diller P., 2008). Известно, что провоспалительные цитокины оказывают неблагоприятное влияние на функциональное состояние миокарда (Kelly R.A., 1997). Нами изучена динамика экспрессии IL-1 и TNF-α в зависимости от степени НК. Полученные данные неоднозначны (табл.3). Наибольший уровень экспрессии обоих цитокинов получен у детей с НК IIA, а при утяжелении НК наблюдается снижение их экспрессии в лимфоцитах, хотя она по-прежнему остается выше, чем в группе сравнения. Объяснением этого явления, возможно, служит тот факт, что 3 из 8 детей в группе НК IIБ получали глюкокортикоиды (преднизолон), обладающие мощным противовоспалительным действием. |
Похожие:
 | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Особенности развития детей раннего возраста. Конспект (Н. М. Аксарина «Воспитание детей раннего возраста») |  | Теоретические основы проблемы адаптации детей раннего возраста к... Психологические особенности детей раннего возраста |
| Клинико-морфологических особенности атрезии внепеченочных желчных... Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский Государственный Медицинский... | | Клинико-иммунологические особенности хронического вирусного гепатита... Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Казанская медицинская... |
| Педиатрия для студентов VI курса Темы рефератов по циклу «Патология детей старшего возраста» Роль участкового педиатра в выявлении групп риска детей и подростков с высокой вероятностью развития артериальной гипертензии | | 2 Особенности организации образовательного процесса в группах раннего возраста Музей Екатеринославской школы (далее музей) организует свою работу в целях воспитания, развития, обучения и социализации детей и... |
| Клинико-лабораторные и иммунологические особенности острых гепатитов... А. А. Ключарева, Белорусская медицинская академия последипломного образования, кафедра инфекционных болезней | | План работы городского методического объединения проблемная группа... Цель: Создание модели социального партнёрства педагога доу с родителями детей раннего возраста |
| Факторы риска и коморбидные состояния у детей раннего возраста с... Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный... | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Учебно-методический комплекс дисциплины (умкд) «Особенности психического развития детей раннего возраста» для студентов зочной формы... |
| Применение электрохимических и йодсодержащих препаратов для лечения... Животные, кролики, йодсодержащий препарат-йодпротектин, электрохимические растворы, лечение, профилактика, иммунологические и биохимические... | | Затяжное течение острых средних отитов у детей раннего возраста (клинико-аудиологические... Зателепин Олег Кимович кандидат юридических наук, доцент, помощник заместителя Председателя Верховного Суда Российской Федерации... |
| Рабочая учебная программа по дисциплине Изучить морфологические, цито-, биохимические и функциональные особенности клеток крови, особенности картины периферической крови... | | «Вклад отечественных и зарубежных ученых в становление теории и методики... Современные проблемы познавательно-речевого развития детей раннего и дошкольного возраста |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Тема: Общие закономерности физического и психического развития детей раннего возраста | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель: получения работы по специальности дошкольного образования, квалификации воспитатель детей дошкольного возраста с дополнительной... |
