5. Среда разбавления исследуемого материала
5.1. Для разбавления применяют 0,56-процентный раствор аптечной морской соли, рН 7,0 - 7,5.
5.2. Приготовленный раствор разливают в колбы на 150 - 200 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. 30 мин. или дробно в аппарате Коха три дня подряд по 15 мин.
5.3. В среде разбавления инфузории не размножаются, но сохраняют жизнеспособность 30 - 45 дней.
6. Приборы, посуда, материалы и реактивы
6.1. Приборы: термостат, автоклав, аппарат Шуттель, микроскоп световой МБС, потенциометр, весы аналитические, сушильный шкаф, центрифуга, водяная баня, аппарат Коха, мясорубка, гомогенизатор, камеры Фукс-Розенталя, штативы.
6.2. Посуда: фарфоровые ступки, колбы Кьельдаля, конические колбы Эрленмейера на 50 мл, пастеровские пипетки, стеклянные палочки, мерные пипетки на 0,1 - 10 мл, предметные и покровные стекла, флаконы из-под антибиотиков с резиновыми пробками, у которых в центре вставлены стеклянные трубки с ватными пробками с целью аэрации среды, воронки.
6.3. Материалы: вата, марля, индикаторная и фильтровальная бумага.
6.4. Реактивы: пептон бактериологический, дрожжевой экстракт, глюкоза в порошке, аптечная морская соль, хлористый натрий, 5-процентный спиртовой раствор йода, 10-процентный раствор натра едкого, стандартный казеин, порошок сублимированного куриного яйца.
7. Подготовка проб для исследования
7.1. От 10 экземпляров исследуемой партии рыб в области спины берут по 15 - 20 г мяса без кожи (всего 150 - 200 г), три-четыре раза пропускают через мясорубку, тщательно перемешивают и гомогенизируют. Затем отвешивают 5 - 10 г гомогената, помещают в фарфоровые ступки и тщательно растирают. Срок хранения в холодильнике при температуре минус 10 - 15 °С до 2 мес. (пробы хранят в стаканчиках с притертыми крышками).
7.2. Подготовку проб от других гидробионтов проводят аналогичным образом, только от каждой исследуемой партии отбирают 30 экземпляров раков, мидий и 50 моллюсков.
8. Контроль роста инфузорий
8.1. Ежедневно контролируют рост инфузорий и его интенсивность. Предварительно просматривают пробы в пробирках или флаконах под микроскопом МБС. Затем пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой берут каплю культуры, помещают на предметное стекло и под малым увеличением микроскопа (7 х 8) просматривают объем капли, все ее слои.
8.1.1. При этом определяют чистоту культуры, густоту роста, форму, подвижность и наличие погибших инфузорий.
8.2. Число выросших особей проводят под микроскопом в счетной камере Фукс-Розенталя. На подсчет 40 проб требуется 6 - 7 ч.
Предварительно инфузории фиксируют, вносят во флаконы по одной капле 5-процентного спиртового раствора йода.
8.2.1. При густом росте (100 и более клеток в одном поле зрения микроскопа) культуру инфузорий разбавляют в пять - десять раз стерильным 0,56-процентным раствором аптечной морской соли. Среднее число инфузорий в одном квадрате умножают на разведение.
8.3. Число инфузорий записывают по следующей форме:
┌─────┬───────┬──────────────────────────────────────┬───────────┐
│Номер│Повтор-│ Число клеток в квадратах │Среднее │
│пробы│ность ├───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬──┤число кле- │
│ │ │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │ 7 │ 8 │ 9 │10│ток в одном│
│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │квадрате │
├─────┼───────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼──┼───────────┤
│ 1 │ 1 │32 │32 │31 │30 │25 │39 │35 │37 │37 │33│33,1 │
│ │ 2 │31 │28 │35 │27 │26 │28 │41 │39 │37 │40│34,3 │
│ │ 3 │24 │32 │31 │27 │26 │25 │42 │39 │37 │24│30,7 │
│ │ │Среднее число клеток в пробе из трех │32,7 │
│ │ │повторностей │ │
└─────┴───────┴──────────────────────────────────────┴───────────┘
8.4. Число выросших инфузорий учитывают в 1 мл культуры. Для этого
4
среднее число клеток в пробе делят на два и умножают на 10 .
Примечание. Инфузории каждой пробы подсчитывают в трех повторностях и за конечный результат принимают среднее число клеток.
9. Определение токсичности рыбы и других гидробионтов
9.1. Токсикологическим исследованиям подвергают рыбу и другие гидробионты, подозреваемые в отравлении и выловленные из загрязненных водоемов, а также рыбу, содержащую в определенное время года биологические токсины.
9.2. Из приготовленной пробы (п. 7) берут навески 50, 100, 200 мг, помещают во флаконы, добавляют в каждый 2 мл 0,56-процентного раствора аптечной морской соли и 0,04 мл трехсуточной культуры инфузорий, выращенных на пептонной среде. Каждый образец исследуют в трех повторностях.
Контролем при анализе служат флаконы, содержащие 0,56-процентный раствор аптечной морской соли, заведомо нетоксичные пробы мяса гидробионтов, стандартный казеин или сублимированное куриное яйцо.
9.2.1. Флаконы тщательно встряхивают и помещают в термостат при температуре 25 °С или оставляют при комнатной температуре на 24 ч.
В течение суток флаконы три-четыре раза встряхивают с целью аэрации среды и поднятия осевших частиц исследуемого материала.
9.3. Через 1, 4, 6, 24 ч посевы из каждого флакона просматривают под микроскопом.
10. Оценка токсичности рыбы и других гидробионтов
10.1. Токсичность исследуемых образцов определяют по наличию погибших инфузорий, измененных форм, характеру движения и угнетенного роста Тетрахимены пириформис.
10.2. Наличие мертвых или деформированных клеток, замедление или изменение движения, угнетение роста и размножения инфузории свидетельствуют о токсичности исследуемого материала и наоборот.
10.3. Одновременно определяют токсичность воды, из которой выловлена рыба.
11. Определение токсичности воды
11.1. Аппаратура, материалы и реактивы такие же, как и при определении токсичности рыбы.
11.2. Пробы воды (2 - 3 л) берут непосредственно на месте гибели рыбы и других гидробионтов. Брать пробы надо так, чтобы образец соответствовал составу всей массы исследуемой воды: из поверхностных (30 - 50 см от поверхности) и глубинных слоев, на быстринах, перепадах, водосбросах и водоспусках. При этом необходимо исключить временную взмученность, случайное загрязнение и др.
11.3. Пробы воды упаковывают и направляют в ветеринарную лабораторию для исследования.
12. Проведение анализа и оценка токсичности воды
12.1. Отобранные пробы по 2 мл разливают во флаконы, затем добавляют в каждый 0,04 мл трехсуточной культуры инфузорий, выращенных на пептонной среде. Каждую пробу воды исследуют в трех повторностях.
Контролем при анализе служат флаконы, содержащие 0,56-процентный раствор аптечной морской соли, отстоявшуюся водопроводную воду, заведомо нетоксичные пробы воды из благополучных водоемов.
12.2. Флаконы тщательно встряхивают и помещают в термостат при температуре 25 °С или оставляют при комнатной температуре на 24 ч.
В течение суток флаконы три-четыре раза встряхивают с целью аэрации среды.
12.3. Через 1, 2, 4, 6, 24 ч пастеровской пипеткой берут каплю культуры инфузорий и просматривают под микроскопом.
12.4. Результаты оценивают так же, как и при определении токсичности рыбы (см. раздел 10).
13. Определение токсигенности рыб и других гидробионтов
13.1. Для дифференциальной диагностики токсикозов рыб и других гидробионтов, вызываемых воздействием ядов микробного происхождения, исследование проводят одновременно с прогреванием проб при 80 - 120 °С в течение 30 - 60 мин. Параллельно исследуют непрогретые пробы.
13.2. На токсигенность исследуют рыбу и другие гидробионты (снулые, лежалые, травмированные, больные), сомнительные при ветеринарно-санитарном осмотре в отношении доброкачественности и пригодности в пищу.
13.3. Исследуемые образцы мяса рыб и других гидробионтов прогревают отдельно или в среде разбавления, охлаждают до температуры 18 - 20 °С и засевают инфузориями с последующим учетом результатов, как при определении токсичности рыбы (разделы 9, 10).
Контролем служат флаконы, содержащие 0,56-процентный раствор аптечной морской соли, свежие пробы мяса аналогичного вида гидробионтов, стандартный казеин или сублимированное куриное яйцо.
13.4. Если непрогретые пробы вызывают гибель и другие патологические изменения инфузорий, то проводят дополнительные исследования с использованием существующих бактериологических методов с целью определения видовой принадлежности микроорганизмов.
14. Определение питательной ценности гидробионтов
14.1. Из приготовленных проб (раздел 7) берут навеску 50 мг и вносят в фарфоровую ступку, добавляют 8 мл 0,56-процентного раствора аптечной морской соли и тщательно растирают пестиком 2 - 3 мин. до получения однородной массы. Градуированной пипеткой в три флакона вносят по 2 мл содержимого ступки. Каждую пробу исследуют в трех повторностях. Оставшиеся 2 мл смеси взяты с учетом поправки на неизбежные потери.
14.2. Контролем при анализе служат флаконы, содержащие 0,56-процентный раствор аптечной морской соли без исследуемого образца, флаконы с казеином или сублимированным куриным яйцом (как стандарт) или же пробы сравниваемых образцов рыб и других гидробионтов. Контрольные пробы готовят и исследуют аналогично опытным.
14.3. В каждый флакон с пробой добавляют 0,04 мл (одну каплю) трехсуточной культуры инфузорий, выращенных на пептонной среде.
14.4. Флаконы закрывают пробками, тщательно встряхивают, помещают в специальные штативы и инкубируют в термостате три дня при температуре 25 °С или при комнатной температуре.
14.5. В процессе инкубирования флаконы встряхивают три-четыре раза в день. При массовых исследованиях для встряхивания большого количества проб используют аппарат Шуттель с автоматическим режимом работы. Его помещают в термостат соответствующих размеров.
14.6. Ежедневно флаконы просматривают визуально и под микроскопом. Флаконы с видимой посторонней микрофлорой (плесень и др.) бракуют и исследование повторяют.
15. Оценка результатов определения питательной
ценности гидробионтов
15.1. Питательную ценность гидробионтов определяют по интенсивности размножения инфузорий на питательном субстрате, содержащем в качестве источника белка и стимуляторов роста исследуемые образцы. Показателем питательной ценности служит число выросших за три дня инфузорий на опытном образце по отношению к числу клеток, полученных на контроле (п. 14.2), выраженное в процентах.
15.2. После инкубирования из каждого флакона пастеровской пипеткой берут одну каплю культуры на предметное стекло и просматривают под малым увеличением микроскопа. При этом определяют число мертвых инфузорий, форму, величину, подвижность, густоту роста. При наличии мертвых и деформированных инфузорий флаконы бракуют и исследование повторяют.
15.3. После предварительной оценки образцов подсчитывают инфузории в опытных и контрольных пробах (раздел 8).
15.4. Полученные результаты сравнивают. Вычисляют процент роста, что определяет питательную ценность по сравнению с контролем.
Пример подсчета. Среднее число инфузорий, выросших в пробе с
4
контрольным образцом (карп клинически здоровый), составляет 30 х 10 шт. в
1 мл, а в пробе с опытным (карп, погибший от асфиксии в результате
4
отравления аммиаком) - 24 х 10 шт. в 1 мл. Относительная питательная
ценность мышечной ткани последнего образца равняется 80%. Таким образом,
можно сделать заключение, что рыба, отравленная аммиаком, на 20% менее
питательна, чем здоровая. При всех отравлениях, а также у больной, лежалой,
снулой, свежемороженой рыбы биологическая ценность обычно понижена.
Приложение 4
МАКСИМАЛЬНО ДОПУСТИМЫЕ УРОВНИ СОДЕРЖАНИЯ ПЕСТИЦИДОВ
В РЫБЕ И РЫБОПРОДУКТАХ, МГ/КГ
(утв. Министерством здравоохранения СССР 30 декабря 1987 г.)
┌─────────────────────────────────────────────────┬──────────────┐
│ Пестицид (синонимы) │ Максимально │
│ │ допустимый │
│ │ уровень │
├─────────────────────────────────────────────────┼──────────────┤
│Алдрин │Не допускается│
│Афос (ФС-УМО) │То же │
│Афуган (пиразофос) │-"- │
│Гексахлоран (сумма изомеров ГХЦГ): │ │
│ рыба пресноводная (хищная и бентосоядная): │ │
│ свежая, охлажденная, мороженая │0,03 │
│ соленая, копченая, вяленая │0,2 │
│Гептахлор (гептазол, гептанал, велзикол-104) │Не допускается│
│Гамма-изомер ГХЦГ (линдан, гексалин, гексаталп, │0,002 │
│ТАП-85) │ │
│2,4-Д аминная соль │Не допускается│
│2,4-Д бутиловый эфир-бутопон │То же │
│2,4-Д дихлорофеноксиуксусная кислота │-"- │
│2,4-Д дихлорфенол │-"- │
│2,4-Д кротиловый эфир │-"- │
│2,4-Д малолетучие эфиры │-"- │
│2,4-ДМ │-"- │
│2,4-Д октиловый эфир (октапон) │-"- │
│2,4-Д хлорокротиловый эфир │-"- │
│ДДТ и его метаболиты (фольбокс, термические │ │
│полоски): │ │
│ рыба пресноводная (хищная и бентосоядная): │ │
│ свежая, охлажденная, мороженая │0,3 │
│ соленая, копченая, вяленая │0,4 │
│Диурон (кармекс, гербатокс) │0,03 │
│ДНОК (синокс, динитроортокрезол) │Не допускается│
│Камбилен │То же │
│Метилмеркаптофос (дематон, метил, метасистокс) │-"- │
│Метафос (вофаток паратион-метил, метацид, │-"- │
│фолидол) │ │
│Дихлоральмочевина │-"- │
│Нитрафен │-"- │
│Оксамат │-"- │
│Пентахлорфенолят натрия │-"- │
│Пропоксур (байгон, больфо) │-"- │
│Ртутьсодержащие пестициды │-"- │
│Тиазон (дазомет, мидон) │0,5 │
│Тиофос (паратион) │Не допускается│
│Тирам (тиурам, ТМТД) │То же │
│Трихлорметафос-3 (трихлороль) │-"- │
│Фозалон (бензофосфат, золон, рубитокс) │-"- │
│Цирам (цимет) │-"- │
└─────────────────────────────────────────────────┴──────────────┘
Приложение 5
ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВЕЖЕСТИ РЫБЫ
При обнаружении признаков несвежести рыбы проводят бактериоскопию, определяют сероводород с подогреванием пробы и концентрацию водородных ионов (рН), содержание аминоаммиачного азота и продуктов первичного распада белков в бульоне (реакция с сернокислой медью), ставят реакцию на пероксидазу и редуктазную пробу, проводят люминесцентно-спектральный анализ. В необходимых случаях для характеристики пищевых и кормовых достоинств рыбы дополнительно определяют химический состав, биологическую ценность (безвредность, питательность), видовую принадлежность микроорганизмов и содержание влаги в мясе исследуемых рыб. В малооборудованных лабораториях для оценки доброкачественности рыбы ограничиваются бактериоскопией мазков-отпечатков, реакцией на пероксидазу или редуктазу, определением сероводорода, рН и безвредности рыбы.
Бактериоскопия. На предметных стеклах делают два мазка-отпечатка: один - из поверхностных слоев мышц, расположенных под кожей, другой - из мышечной ткани глубоких слоев мышц, находящихся около позвоночника. Приготовленные препараты красят по Граму. Под микроскопом подсчитывают среднее число микроорганизмов в одном поле зрения.
Рыба свежая - в мазках из поверхностных слоев мышц микробов нет или единичные кокки и палочки в нескольких полях зрения. Препарат плохо окрашен, на стекле не заметно остатков разложившейся ткани.
Рыба сомнительной свежести - в мазках из глубоких слоев мышц 10 - 20, а из поверхностных - 30 - 50 микробов в одном поле зрения (диплококки, диплобактерии). Препарат окрашен удовлетворительно, на стекле ясно заметны распавшиеся волокна мышечной ткани.
|
