Рыба несвежая - в мазках из глубоких слоев мышц 30 - 40, а из поверхностных - 80 - 100 и более микробов в одном поле зрения (преимущественно палочковидных). Препарат хорошо окрашен, на стекле много распавшейся мышечной ткани.
Определение сероводорода с подогреванием пробы. В пробирку (рыхло) помещают 5 - 7 г фарша мяса рыбы. Под пробку закрепляют полоску фильтровальной бумаги, смоченную 10-процентным щелочным раствором уксусно-кислого свинца. Диаметр капли не более 5 мм. Бумажка не должна прикасаться к мясу и стенкам пробирки. Контролем служит пробирка с фильтровальной бумагой, смоченной дистиллированной водой. Пробирки подогревают на водяной бане при температуре 48 - 52 °С в течение 15 мин. и после этого немедленно читают реакцию: рыба свежая - реакция отсутствует (бумага белая, как в контроле); рыба сомнительной свежести - на бумаге появляется слабо-бурое пятно (следы сероводорода); рыба несвежая - цвет капли на бумаге от бурого до темно-коричневого.
Определение концентрации водородных ионов (рН). К 5 г фарша мяса рыбы добавляют 50 мл дистиллированной воды и настаивают 30 мин при периодическом помешивании, фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат используют для исследования. Определяют рН с помощью потенциометра (рН-метра) или индикаторной бумаги. У рыбы свежей фильтрат слегка опалесцирует, рН до 6,9; у рыбы сомнительной свежести - слегка мутноватый, рН 7,0 - 7,2; у несвежей - мутный, запах неприятный, рН 7,3 и выше.
Определение содержания аминоаммиачного азота. В колбу вместимостью 100 мл к 10 мл профильтрованной через фильтровальную бумагу водной вытяжки из мяса добавляют 40 мл дистиллированной воды и три капли 1-процентного спиртового раствора фенолфталеина. Содержимое колбы нейтрализуют децинормальным раствором натра едкого до слабо-розового окрашивания. Затем в колбу добавляют 10 мл формалина, нейтрализованного по фенолфталеину до слабо-розовой окраски. В результате освобождения карбоксильных групп смесь становится кислой и розовый цвет индикатора исчезает. После этого содержимое колбы снова титруют децинормальным раствором натра едкого до слабо-розовой окраски. Так как 1 мл децинормального раствора натра едкого эквивалентен 1,4 мг азота, то количество миллилитров децинормального раствора натра едкого, пошедшего на второе титрование, умножают на 1,4 и получают количество аммиачного азота (в мг) в 10 мл фильтрата мясной вытяжки.
Пресноводная свежая рыба содержит в мясе до 0,69 мг аминоаммиачного азота, рыба сомнительной свежести - 0,7 - 0,8, а несвежая - свыше 0,81 мг.
Метод определения продуктов первичного распада белков в бульоне (реакция с сернокислой медью). В коническую колбу Эрленмейера на 200 мл помещают 20 г фарша из спинных мышц рыбы, добавляют 60 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Колбу накрывают часовым стеклом и нагревают в течение 10 мин. в кипящей водяной бане. Затем горячий бульон фильтруют через плотный слой бумажно-ватного фильтра в пробирку, помещенную в стакан с холодной водой. Если в фильтрате остаются хлопья белка, то его снова фильтруют.
После фильтрации 2 мл бульона наливают в пробирку и добавляют три капли 5-процентного раствора сернокислой меди, встряхивают два-три раза и выдерживают 5 мин. Контролем служит бульон в пробирке без добавления сернокислой меди.
Бульон из мяса свежей рыбы слегка мутнеет, из рыбы сомнительной свежести - заметно мутный, а из несвежей - характеризуется образованием хлопьев или выпадением желеобразного сгустка сине-голубого цвета.
Реакция на пероксидазу (бензидиновая проба). В бактериологическую пробирку вносят 2 мл водной вытяжки (1:10) из жаберной ткани и добавляют 5 капель 0,2-процентного спиртового раствора бензидина. Содержимое пробирки взбалтывают, после чего вносят две капли 1-процентного раствора перекиси водорода.
Вытяжка из жаберной ткани свежих рыб дает синюю окраску, переходящую за 1 - 2 мин. в коричневую.
Вытяжка из жаберной ткани рыб сомнительной свежести дает менее интенсивную окраску и значительно позже переходит в коричневую (через 3 - 4 мин.).
Вытяжка из жаберной ткани несвежей рыбы не дает синей окраски, а непосредственно переходит в коричневый цвет (отрицательная реакция на пероксидазу).
Редуктазная проба. В бактериологическую пробирку вносят 5 г фарша из мяса рыбы, заливают двойным количеством дистиллированной воды, встряхивают и оставляют на 30 мин. Затем приливают 1 мл 0,1-процентного водного раствора метиленового голубого, пробирку энергично встряхивают для равномерной окраски фарша, заливают слоем вазелинового масла толщиной 0,5 - 1 см. Смесь помещают в термостат при 37 °С и периодически ведут наблюдение за обесцвечиванием экстракта. Чем быстрее произойдет обесцвечивание вытяжки из рыбы, к которой добавлен метиленовый голубой, тем больше содержится в ней фермента редуктазы (дегидразы), а следовательно, и больше микроорганизмов, его продуцирующих.
ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ
┌────────────────────┬───────────────────┬───────────────────────┐
│Время обесцвечивания│Количество микробов│Санитарная оценка рыбы │
│ │ в 1 г мяса │ │
├────────────────────┼───────────────────┼───────────────────────┤
│ │ 6 │ │
│До 40 мин. │10 и выше │Недоброкачественная │
│ │ │ │
│ │ 4 5 │ │
│40 мин. - 2,5 ч │10 - 10 │Сомнительной свежести │
│ │ │ │
│ │ 3 │ │
│2,5 - 5 ч или не │До 10 │Свежая │
│обесцвечивается │ │ │
└────────────────────┴───────────────────┴───────────────────────┘
Примечание. При учете результатов реакции сохранение синего кольца под слоем вазелинового масла в расчет не принимать.
Люминесцентно-спектральный анализ. Исследуют под люминесцентным микроскопом непосредственно кусочки глубоких слоев спинных мышц. Под действием ультрафиолетовых лучей длиной волны 360 - 370 нм мышечная ткань только что убитых рыб флюоресцирует сине-голубоватым цветом, а капельки крови дают темно-коричневую окраску.
При хранении рыбы без воды в течение 10 ч при комнатной температуре окраска мышечной ткани и крови приобретает более интенсивный оттенок.
У рыб сомнительной свежести мышцы светятся тускло-синеватым цветом с фиолетовым оттенком или серо-синеватым со слабым желтоватым оттенком. Кровь флюоресцирует светло-коричневым цветом.
Мясо несвежих рыб светится тусклым сине-голубым цветом с желто-зеленоватым оттенком. Кровь имеет оранжевое свечение.
Определение безвредности (токсичности) и питательной ценности рыбы. Проводят экспрессный микрометод токсико-биологической оценки рыбы и других гидробионтов, изложенный в Приложении 3 настоящих Правил.
Определение содержания влаги в мясе рыбы. Содержание влаги определяют высушиванием проб мяса в сушильном шкафу при 105 °С до постоянной массы сухого вещества. С этой целью отвешивают пробы массой 5 г, раскладывают в предварительно взвешенные сухие чашки Петри и помещают в сушильный шкаф. На протяжении двух-трех дней проводят три-четыре взвешивания чашек Петри с пробами мяса. Перед взвешиванием чашки с пробами охлаждают в эксикаторах с концентрированной серной кислотой. Анализ считается законченным, если результаты двух последних взвешиваний не превышают предыдущих (+/- 0,01 г).
Влагу вычисляют путем разности массы чашки с пробой мяса до высушивания и после него. Содержание ее выражают в процентах в 100 г сырой ткани.
Определяют влагу каждой пробы в трех повторностях и за конечный результат принимают среднее.
Контролем для сравнения служат средние данные по содержанию влаги в мясе пресноводных рыб (78 - 79%), а более точный контроль - результаты одновременного определения влаги в мясе только что убитых рыб того же вида и возраста, что и вынужденно исследуемых.
Чем выше общее количество воды в мясе рыбы, тем ниже ее качество. Такая рыба начинает быстро разлагаться.
Неживая рыба при хранении в воде легко впитывает (имбибирует) жидкость. Снулые карпы через 20 ч увеличивают массу на 2 - 3%, растительноядные - до 5%. Увеличение массы на 1 - 2% за счет оводнения мышц отмечается у живых ослабленных рыб: больных, отравленных, утомленных, травмированных, выращиваемых в плохих гидрохимических условиях.
Идентификация токсинов клостридий перфрингенс при помощи реакции гемолиза. Сущность ее состоит в том, что при наличии в исследуемом материале или культуре токсинов клостридий перфрингенс происходит их нейтрализация при добавлении гомологичных антитоксических сывороток и гемолиз эритроцитов не наступает. Реакция позволяет определить наличие гемотоксина клостридий перфрингенс и установить его специфичность нейтрализацией типоспецифическими антисыворотками.
Пробы отбирают согласно ГОСТ 21237-75 "Мясо. Методы бактериологического анализа". Стерильную навеску 10 г подвергают (в стерильных условиях) гомогенизации или растирают в стерильной ступке. Из полученного гомогената делают посевы на среду Китта-Тароцци и готовят суспензию на стерильном физиологическом растворе для реакции гемолиза.
Ставят реакцию следующим образом. Берут ряд агглютинационных пробирок (число их зависит от объема работы), в которые разливают по 0,5 мл 2,5-процентной взвеси отмытых физиологическим раствором эритроцитов барана. В одну из пробирок добавляют 0,5 мл исследуемой суспензии и 0,2 мл физиологического раствора (контроль), а в другие - 0,5 мл исследуемой суспензии и 0,2 мл соответствующей антитоксической сыворотки клостридий перфрингенс типов A, B, C, D, выпускаемых в нашей стране. Смесь исследуемой суспензии с антитоксической сывороткой для нейтрализации гемолизина вначале выдерживают 30 мин. в термостате при 37 °С, рН реакционной смеси 7.
После смешивания всех компонентов пробирки встряхивают и ставят на 2 ч в термостат при температуре 37 °С, а затем выдерживают 24 ч при комнатной температуре.
Результаты реакции регистрируют через 2 и 24 ч. Интенсивность ее обозначают крестами (табл.).
ВЫЯВЛЕНИЕ ТОКСИНОВ КЛОСТРИДИЙ ПЕРФРИНГЕНС
ПРИ ПОМОЩИ РЕАКЦИИ ГЕМОЛИЗА
┌───────────┬────────────────────────────────────────────────────┐
│ Типы │ Результат реакции гемолиза │
│клостридий ├─────────┬──────────────────────────────────────────┤
│перфрингенс│ без │ с антитоксическими сыворотками │
│ │сывороток├───────────────────┬──────────────────────┤
│ │ │ против клостридий │противоботулиническими│
│ │ │ перфрингенс │ │
│ │ ├────┬────┬────┬────┼────┬─────┬─────┬─────┤
│ │ │ A │ B │ C │ D │ A │ B │ C │ E │
├───────────┼─────────┼────┼────┼────┼────┼────┼─────┼─────┼─────┤
│ A │++++ │- │- │++++│++++│++++│++++ │++++ │++++ │
│ B │++++ │++++│- │- │++++│++++│++++ │++++ │++++ │
│ C │++++ │++++│- │- │++++│++++│++++ │++++ │++++ │
│ D │++++ │++++│- │++++│- │++++│++++ │++++ │++++ │
└───────────┴─────────┴────┴────┴────┴────┴────┴─────┴─────┴─────┘
Примечание. "++++" - полный гемолиз эритроцитов; "-" - отсутствие его.
Выращенные 18-часовые культуры клостридий перфрингенс центрифугируют при 6000 об./мин. и с полученным центрифугатом ставят реакцию гемолиза на выявление токсина по описанной выше методике. Для контроля в реакции нейтрализации можно использовать противоботулинические сыворотки.
О наличии токсина клостридий перфрингенс и его типовой принадлежности судят по отсутствию реакции гемолиза (нейтрализованный токсин реакции гемолиза не вызывает).
Антитоксическая сыворотка клостридий перфрингенс типа A нейтрализует только токсин клостридий перфрингенс типа A; антитоксическая сыворотка клостридий типа D нейтрализует только токсин типа D; антитоксическая сыворотка клостридий перфрингенс типа B нейтрализует токсин клостридий перфрингенс типов A, B, C и D; антитоксические сыворотки клостридий перфрингенс типов B и C нейтрализуют друг друга. Противоботулинические сыворотки не вызывают нейтрализации токсинов клостридий перфрингенс.
Метод очень прост по технике выполнения и может быть использован даже в недостаточно оборудованных лабораториях. Схема постановки реакции гемолиза и ее результат приведены в таблице.
Идентификация клостридий ботулинум и клостридий перфрингенс люминесцентно-серологическим методом. Для экспрессной идентификации клостридий ботулинум и клостридий перфрингенс рекомендуется люминесцентно-серологический метод.
В исследованиях используют непрямой метод люминесцирующих антител. Берут сухие ослиные против глобулинов кролика люминесцирующие сыворотки, изготовляемые Институтом эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи. В качестве иммунных (промежуточных) используют противоботулинические и антиперфрингенс типоспецифические агглютинирующие сыворотки.
Мазки для обработки методом непрямой иммунофлуоресцентной окраски готовят непосредственно из мышц рыб (мазки-отпечатки) или из отмытых двух-трехсуточных культур клостридий ботулинум и 16 - 18-часовых культур клостридий перфрингенс, выращенных на среде Китта-Тароцци.
После подсушивания на воздухе мазки фиксируют в метиловом спирте 5 - 10 мин. Затем на препараты наносят гомологичные для каждого типа клостридий иммунные сыворотки в их рабочем разведении и помещают на 20 мин. во влажную камеру при 37 °С. После этого препараты промывают два раза по 10 мин. 0,15 н. раствором поваренной соли (рН 7,2 - 7,4).
Обработанные на первом этапе мазки окрашивают 20 мин. люминесцирующей антивидовой сывороткой в разведении 1:32 в условиях влажной камеры. В дальнейшем мазки тщательно промывают 0,15 н. раствором поваренной соли (рН 7,2 - 7,4), ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.
Приготовленные препараты просматривают под люминесцентным микроскопом
МЛ-2 с использованием светофильтров ФС-1-4; СЗС-7-2; ВС-8,2; запирающего
х х х
светофильтра Т-2-Н; масляной иммерсии 90 х 1,25, окуляров 5 , 7 и 10 при
силе тока 4,5 - 5,5 ампера.
У всех типов клостридий ботулинум и клостридий перфрингенс, обработанных соответствующими компонентами непрямого метода иммунофлуоресцентной окраски, наблюдается специфическое (феномен "светящегося ободка") ярко-зеленое (++++) или зеленое средней яркости (+++) свечение вегетативных, споровых и спорообразующих форм клостридий. Наличие яркого светящегося ободка вокруг микробной клетки свидетельствует о специфичности реакции иммунофлуоресценции. У клостридий ботулинум типов A и B, обработанных перекрестно соответствующими сыворотками, отмечается свечение с одинаковой интенсивностью (++++) или (+++), в то время как у других типов клостридий перфрингенс ботулинум (C, D, E) и клостридий перфрингенс типов A, B, C, D наблюдается специфическое свечение только при обработке гомологичными иммунными сыворотками.
Интенсивность и специфичность свечения клостридий не зависит от биохимической активности и токсигенности микроорганизмов. Свечения других видов микроорганизмов не наблюдается или различаются темные тени микробных клеток на серо-зеленом фоне (+-).
Для того чтобы получить положительный результат, достаточно в поле зрения микроскопа трех-четырех искомых микробных клеток.
Однако лучшие результаты достигаются при центрифугировании суспензии исследуемого материала с целью концентрации микроорганизмов (5000 об./мин.).
С помощью люминесцентно-серологического метода продолжительность исследования на наличие и типизацию клостридий ботулинум и клостридий перфрингенс в мазках-отпечатках сокращается до 3 ч, а с подращиванием на питательной среде Китта-Тароцци - до 48 - 72 и 16 - 18 ч соответственно против 6 - 14 суток существующими классическими методами бактериологического исследования.
Приложение 6
БОЛЕЗНИ ЧЕЛОВЕКА, ИСТОЧНИКАМИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КОТОРЫХ
ЯВЛЯЮТСЯ ПРЕСНОВОДНАЯ РЫБА И РАКИ
┌─────────────────┬────────┬──────────────┬────────┬──────────────────────┐
│Болезни человека │Возбуди-│Пути заражения│Патоген-│ Меры борьбы │
│и наиболее харак-│тель │ человека │ность │ │
│терные симптомы │ │ │для вод-│ │
│ │ │ │ных ор- │ │
│ │ │ │ганизмов│ │
|
