Сэндвич-метод иммуноферментного определения hbsAg с помощью рн чувствительных сорбируемых моноклональных антител 14. 03. 09 клиническая иммунология, аллергология
Скачать 291.55 Kb.
|
На правах рукописи Яковлева Динора Абдуллаевна СЭНДВИЧ-МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ HBsAg С ПОМОЩЬЮ рН ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ СОРБИРУЕМЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2012Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" РАМН
Защита состоится 15 марта 2012 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064 г. Москва, Малый Казенный пер., д.5а.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук И.В. Яковлева ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Твердофазный иммунохимический сэндвич-метод определения антигенов белковой природы широко используется в различных областях биологии и медицины, в том числе для выявления маркеров вирусных инфекций [Егоров, 1991; Khan and Findlay, 2010]. Традиционная схема сэндвич-метода включает несколько стадий. Во-первых, на твердую фазу адсорбируют моноклональные антитела (МКА), специфичные в отношении одного из эпитопов тестируемого антигена (иммобилизованные антитела). Затем поверхность твердой фазы инкубируют со смесью определяемого антигена и меченых (детектирующих) антител. Иммобилизованные и меченые антитела направлены, как правило, к разным эпитопам определяемого антигена. В результате иммунной реакции на поверхности твердой фазы образуется трехслойный комплекс: [иммобилизованные антитела - антиген - меченые антитела], называемый сэндвичем. В таком иммунном комплексе концентрация определяемого антигена пропорциональна концентрации меченых антител, детектирующий агент которых (например, фермент) обеспечивает регистрируемый сигнал (окрашивание). Сэндвич-метод с использованием пары МКА к разным эпитопам антигена называют двухсайтным. Благодаря высокой чувствительности, специфичности и относительной простоте исполнения сэндвич-метод нашел широкое применение для скрининга образцов донорской крови на возможную зараженность вирусом гепатита В, а также для ранней диагностики этого заболевания [Лобзин с соавт., 2006]. Вместе с тем, чувствительность тест-систем, производимых ведущими компаниями, варьирует в пределах 0,036 - 0,408 МЕ/мл [H. Scheiblauer et al., 2009].1 Важнейшим фактором, определяющим чувствительность сэндвич-метода, является концентрация активных антигенсвязывающих сайтов антител адсорбированных на поверхности твердой фазы. При прямой (пассивной) сорбции МКА на поверхность иммунных планшетов около 90 - 99 % антител может утерять способность связывать антиген в результате денатурации и неправильной ориентации молекул [Butler, 2004; Liu et al., 2010]. Для сохранения активности иммобилизуемых антител был предложен ряд подходов, предполагающих непрямую сорбцию МКА на поверхность твердой фазы (например, через стрептавидин-биотиновые мостики). Однако пассивная адсорбция по-прежнему остается весьма распространенным способом иммобилизации антител в силу ее простоты и дешевизны. Таким образом, поиск новых методических приемов, позволяющих в максимальной степени сохранить антигенсвязывающую активность иммобилизуемых МКА и тем самым увеличить чувствительность тест-систем, является весьма актуальной задачей. Цель исследования: Конструирование иммуноферментного сэндвич-метода определения HВsAg, основанного на прямой сорбции МКА на поверхность иммунных планшетов и обладающего высокой аналитической чувствительностью; совершенствование метода путем увеличения антигенсвязывающей активности иммобилизуемых МКА путем их адсорбции при различных значениях рН (в том числе экстремально кислых рН). Задачи исследования: 1. Получить панель гибридомных клеточных линий – продуцентов высокоаффинных моноклональных антител к поверхностному антигену вируса гепатита В (HBsAg). 2. Отобрать высокоаффинные МКА, эффективно взаимодействующие с HBsAg серотипов adw и ayw. 3. Подобрать пары МКА (иммобилизуемых и меченых), сочетание которых обеспечивает обеспечивающих высокую аналитическую чувствительность сэндвич-метода. 4. Проанализировать эффективность отобранных МКА в сэндвич-методе после иммобилизации сорбируемых антител на поверхность иммунных планшетов при кислых, нейтральных и щелочных значениях рН. 5. Подобрать условия сэндвич-метода, обеспечивающие обнаружение HBsAg в сыворотке крови больных, инфицированных вирусом гепатита В, в концентрациях 0,02 нг/мл (для n=5). Научная новизна исследования Получена гибридома (18С8) – продуцент уникальных МКА. Антигенсвязывающая активность МКА 18С8 увеличивается более чем в два раза при их адсорбции на поверхность иммунных планшетов в жестких условиях (рН 2,8), в сравнении с адсорбцией при нейтральном значении рН (7,5). Использование МКА 18С8 позволило сконструировать и внедрить в производство сэндвич-метод тестирования HBsAg в сыворотке крови, обеспечивающий минимальную достоверно определяемую концентрацию антигена (для n=5) на уровне 0,013 – 0,017 МЕ/мл. В дополнение к этому метод позволяет определять в сыворотке HBsAg серотипов: аyw2, аyw3varА, аyw3varB, аdr и аdw. Практическая значимость Получена высокочувствительная диагностическая тест-система с высокими аналитическими свойствами для выявления HBsAg в крови. Обнаруженный феномен увеличения антигенсвязывающей активности некоторых МКА при их адсорбции на поверхность иммунных планшетов в "жестких" условиях (рН 2,8) может быть полезен в практической иммунохимии, в частности, при конструировании сэндвич-методов, предназначенных для идентификации инфекционных агентов и других имеющих диагностическое значение белков (гормонов, маркеров инфаркта миокарда, онкомаркёров и т.п.). Наряду с этим описанный феномен может использоваться в конкурентном анализе при создании диагностических систем для тестирования стероидных гормонов и других низкомолекулярных лигандов. Феномен заслуживает дальнейшего изучения, как с теоретической точки зрения, так и в практическом аспекте. | ||||||||||||||||
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Клиническая иммунология Клиническая иммунология: Учебно-методическое обеспечение самостоятельной работы / А. А. Савченко. – Красноярск: Сиб федер ун-т, 2011.... | | Клинико-иммунологическая характеристика больных атопическим дерматитом... Учитель истории и обществознания Гусевской средней общеобразовательной школы Бабаева С. В |
| Феноменология иммунного ответа на т-независимые антигены 2-го типа... В этом плане явились мероприятия, проведенные в 9-11 классах «Нет – наркотикам», «Мы за здоровый образ жизни» с приглашением мед... |  | Сравнительная характеристика натуральных киллерных клеток человека... Охватывает те же этапы, что и протокол предложенный Хиллом, но компания предлагает использовать свою среду неизвестного пользователю... |
| Возможности лаборатории Центра крови 1-го мгму имени И. М. Сеченова Обследование доноров: определение hbsAg, антител к вирусу гепатита С, вич, сифилису | | Метод определения биологического возраста по спирографии Белозерова Л. М., Одегова Т. В. Метод определения биологического возраста по спирографии // Клиническая геронтология. 2006. Т. 12,... |
| Иммунология клиническая иммунология Основной целью обучения является усвоение определенной суммы информации по предмету, а также выработка и развитие у студентов умений... | | Иммунология клиническая иммунология Основной целью обучения является усвоение определенной суммы информации по предмету, а также выработка и развитие у студентов умений... |
| Образовательное учреждение высшего профессионального образования Днк-технологий для выявления генов высокой продуктивности и устойчивости к заболеваниям; диагностики болезней животных посредством... | | Методические рекомендации по организации изучения дисциплины 62 Протокол... «Иммунология – клиническая иммунология» состоит в овладении знаниями по изучению иммунной системы организма человека, форм иммунного... |
| Решена ли проблема корректного определения элементов вторичной структуры? Данный метод был использован для того, чтобы ранжировать шесть методов определения вторичной структуры: stride, dssp, secstr, kaksi,... | | Программа факультативной дисциплины «Аллергология и иммунология» Формирование специальных профессиональных знаний и умений в области клинической иммунологии, аллергологии, необходимых для эффективной... |
| Программа факультативной дисциплины «Аллергология и иммунология» Формирование специальных профессиональных знаний и умений в области клинической иммунологии, аллергологии, необходимых для эффективной... | | Рабочей учебной программы по дисциплине общая и клиническая иммунология... |
| Рабочая программа дисциплины дисциплина сд. Р «Клиническая иммунология» Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Образовательный стандарт послевузовской профессиональной подготовки врача по специальности «аллергология и иммунология», образовательные... |
