Разработка технологии параллельного иммуноферментного и генамплификационного (nat) минипул- тестирования донорской крови на вич, вирусы гепатитов в и с

Скачать 343.24 Kb.

Название	Разработка технологии параллельного иммуноферментного и генамплификационного (nat) минипул- тестирования донорской крови на вич, вирусы гепатитов в и с
страница	1/3
Дата публикации	21.01.2015
Размер	343.24 Kb.
Тип	Автореферат

100-bal.ru > Информатика > Автореферат

1 2 3

На правах рукописи

ЧЕРКАСОВ Евгений Геннадьевич

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПАРАЛЛЕЛЬНОГО

ИММУНОФЕРМЕНТНОГО И ГЕНАМПЛИФИКАЦИОННОГО (NAT) МИНИПУЛ- ТЕСТИРОВАНИЯ ДОНОРСКОЙ КРОВИ НА ВИЧ, ВИРУСЫ ГЕПАТИТОВ В и С

14.00.29 – гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2002

Работа выполнена на станции переливания крови ФУ “Медбиоэкстрем” при Минздраве РФ и в Центральном научно-исследовательском институте трансфузионной медицины и медицинской техники АМТН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, академик АМТН И.Б.Сущенко

доктор медицинских наук, профессор Н.А.Фёдоров

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ В.А. Аграненко

доктор медицинских наук, профессор В.Н. Чеботкевич

Ведущая организация: Российская военно-медицинская академия им. С.М. Кирова МО РФ

Защита состоится «» ___ 2002 г. в час. на заседании диссертационного совета Д 208.074.01 при Российском НИИ гематологии и трансфузиологии по адресу: 193024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.

Автореферат разослан «_»________ 2002

Ученый секретарь диссертационного совета,кандидат медицинских наук В.С. Быков

Актуальность проблемы.
Доноры, инфицированные вирусами иммунодефицита человека, гепатитов В, С, но находящиеся в периоде так называемого “сероконверсионного окна”, являются серонегативными по данным иммуноферментного анализа, но их кровь содержит высокие концентрации этих вирусов. В связи с этим несколько лет тому назад начато международное сотрудничество по созданию стандартов и разработке технологии NAT (Nucleic Amplification Techniques) для тестирования донорской крови, компонентов и препаратов, получаемых из неё. Методическая база для такого NAT –тестирования донорской крови на ВИЧ, вирусы гепатитов В, С на основе отечественных реагентов и аппаратуры была создана в лаборатории генотестирования донорской крови на СПК ФУ «Медбиоэкстрем» и ЦНИИ ТММТ АМТН, но реальная технология и опыт «ИФА- минипул- NAT- тестирования» в России и СНГ до сих пор отсутствовали. Перенос зарубежных коммерческих технологий «ИФА- минипул- NAT- тестирования» в службу крови России пока невозможен как из-за высокой стоимости их, так и по причине отсутствия опыта практического NAT- тестирования крови. Аналогичные трудности существуют и за рубежом, именно поэтому крупные банки крови Европы в своих технологиях используют, так называемые «in-house» тест-системы и национальные стандарты, откалиброванные по международным стандартам. В Японии, Великобритании, Германии, Италии, Канаде,Франции и Австралии «минипул- NAT- тестирование» донорской крови проводится в масштабах целой страны, в крупных центрах лабораторной диагностики, что обеспечивает высокий уровень вирусной безопасности донорской крови.
Цель и задачи исследования.
Учитывая актуальность проблемы обеспечения вирусной безопасности донорской крови, основной целью работы является повышение вирусной безопасности донорской крови, её компонентов и препаратов, выявление бессимптомных серонегативных доноров-вирусоносителей HIV, HCV, HBV и истинных вирусоносителей среди ИФА- положительных доноров.

Для достижения этой цели в работе были поставлены следующие задачи:

Изучить возможности применения однопробирочного варианта экстракции суммарных РНК и ДНК из пулов плазмы, исключающего их потери и осуществить стадию обратной транскрипции РНК HCV и HIV в той же пробирке после растворения осадка в буфере, содержащем фермент обратную транскриптазу.
Отработать ручной («десятки-сотни») и автоматический («8-12-96») с применением самплера фирмы «Гамильтон» варианты подготовки минипулов.
Создать компьютерную программу для формирования минипулов плазм донорской крови в формате 96-луночного планшета с применением штрих-кодирования и отработать технологию передачи по компьютерной сети сопроводительной информации (протоколы и файлы) о полученных результатах NAT- тестирования с последующей выбраковкой ИФА-негативных, но NAT-позитивных донаций крови и плазмы.
Сопоставить частоту идентифицированных NAT-положительных донаций в минипулах и единичных образцах.
Определить частоту выявления NAT-позитивных результатов на РНК HCV и ДНК HBV в группах серонегативных доноров на эти вирусы.
Определить частоту выявления NAT-позитивных результатов на РНК HCV и ДНК HBV в группах доноров серопозитивных на HBsAg и антитела к HCV.
Разработать программу клинико-лабораторного изучения серонегативных, но NAT-позитивных на HCV и HBV доноров совместно с гепатологическим центром Комитета здравоохранения г. Москвы.

Научная новизна
Аналогичные работы в Российской Федерации и СНГ до настоящего времени не проводились. По сравнению с опубликованными в странах Европы, Японии и США результатами внедрения минипул – NAT – тестирования донорской крови, разработаны оригинальные и более простые методические подходы доступные для небольших станций переливания крови.
Практическая значимость работы
Применение дополнительного NAT-минипул тестирования донорской крови снижает риск посттрансфузионных гепатитов и ВИЧ-инфекции у реципиентов донорской крови, её компонентов и препаратов, позволяет выявить истинных вирусоносителей среди ИФА-положительных доноров и осуществить контроль за карантинизируемой плазмой в случае отсутствия повторного ИФА-анализа.
Реализация результатов работы
Отработана и внедрена в ежедневную практику технология параллельного ИФА и NAT-минипул тестирования донорской крови, заготавливаемой на Станции переливания крови ФУ «Медбиоэкстрем» при Минздраве РФ. В инициативном плане, совместно с Гепатологическим консультативным центром КЗ г. Москвы (руководитель д.м.н., проф. Н.П. Блохина) создана программа «Клинико-лабораторного исследования доноров с положительными результатами ИФА- и ПЦР- анализов на вирусные гепатиты В и С», имеющая целью изучить возможности реабилитации доноров с положительными реакциями ИФА- и ПЦР- анализа на вирусы гепатитов В и С путем комплексного изучения в динамике специфических антител, антигенов, вирусных РНК и ДНК в крови и биоптатах печени, биохимических показателей, функционального состояния печени и клинического статуса. В настоящее время начато формирование трех регистров доноров:

1. С высокими значениями оптической плотности ИФА-анализа на антитела к HCV и HBsAg;

2. Серонегативные в ИФА, но положительные на РНК HCV и ДНК HBV;

3. Положительные как по результатам ИФА, так и по результатам ПЦР.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», 6-8 июня 2000 г., г. Санкт-Петербург; семинаре «Минипул-NAT-тестирование донорской крови на ДНК HBV,РНК HCV и ВИЧ», 2-6 октября 2000 г., г. Москва; научно-практической конференции «Актуальные проблемы трансфузионной медицины», 4-5 октября 2000 г., г. Киров; Всероссийской конференции «Методические и практические аспекты фракционирования донорской крови в лечебной практике и донорстве», 28-29 ноября 2000г., ОАО БФА, г. Москва; симпозиуме «Универсальные технологии для генотестирования биоматериалов», 3-7 декабря 2001г., г. Москва; научно-практической конференции «Современные проблемы гематологии и трансфузиологии», 20-21 февраля 2002 г., г. Киров; VIII съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Диагностика, профилактика и лечение инфекционных болезней», 26-28 марта 2002 г., г. Москва; X Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы», 26-31 мая 2002 г., С.- Петербург; Юбилейной Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», 18-20 июня 2002 г., С.- Петербург.

Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Диссертация изложена на 105 страницах печатного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов, указателя литературы, содержащего 48 библиографических источников и двух приложений.
Положения выносимые на защиту
1. Разработанная технология минипул-NAT-тестирования донорской крови на ВИЧ и вирусы гепатитов В и С в ручном и полуавтоматичесчком режиме позволяет выявлять в пулах серонегативной плазмы РНК HCV- и ДНК HBV- позитивные донации в пределах известных вариаций в странах Европы.

2. Частота NAT- позитивных донаций на HCV среди первичных доноров на порядок превышает частоту среди серонегативных кадровых доноров плазмы.

3. NAT- тестирование серопозитивных доноров на HCV и HBV позволяет отделить группу не содержащих РНК и ДНК этих вирусов (45-53%).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ