2.2 Моделирование белка по гомологии
Построение модели по гомологии — полезный метод для предсказания структуры белка по известной последовательности, когда исследуемый белок состоит в родстве хотя бы с одним белком, для которого известны и последовательность, и структура. Если белки являются близкими родственниками, то известные белковые структуры (называемые родительскими) могут служить основой для модели исследуемого белка. И хотя качество модели зависит от степени сходства последовательностей, оценить это качество возможно до экспериментальной проверки. Поэтому знание того, какое качество модели требуется приложением, для которого она предназначена, позволяет с высокой долей вероятности предсказать успешность выполнения задачи [4].
Шаги моделирования по гомологии следующие:
• «Выровнять» аминокислотные последовательности исследуемого белка и белка (белков) с известной структурой. В большинстве случаев вставки и делеции будут наблюдаться в петлях между α-спиралями и β-тяжами.
• Определить сегменты основной цепи, содержащие вставки или делеции. Сшивание этих участков с основной цепью известного белка (матрицы) создает модель основной цепи исследуемого белка.
• Заменить боковые цепи мутировавших остатков. Для немутировавших остатков сохранить конформацию боковых цепей. Мутировавшие остатки склонны сохранять конформацию боковой цепи, и это можно использовать при моделировании. При этом сейчас также доступны вычислительные методы поиска подходящей конформации боковой цепи среди возможных комбинаций.
• Проверить модель (и визуально, и с помощью программ), чтобы выявить значительные наложения атомов. Насколько возможно, устранить подобные наложения вручную.
• Уточнить модель методом ограниченной минимизации энергии. Роль этого шага — установить точное геометрическое расположение в тех местах, где были соединены участки главной цепи, и позволить боковым цепям слегка перемещаться, чтобы занять удобное положение. На самом деле эффект этой процедуры только косметический: минимизация энергии не устранит серьезных ошибок в такой модели [4].
По сути, модель нового белка строится путем внесения минимальных изменений в доступную структуру матрицы. К сожалению, существенно улучшить такую модель непросто. Эмпирическое правило гласит, что если две последовательности идентичны хотя бы на 40-50%, описанная процедура дает модель, достаточно точную для использования во многих приложениях. Если же сходство ниже, то ни описанная процедура, ни какой-либо другой доступный на данный момент алгоритм, не дадут детально точной модели, исходя из доступных структур родственных белков [4].
Структуры большинства белковых семейств содержат как относительно постоянные, так и более вариабельные участки. Ядро структуры семейства сохраняет топологию укладки, хотя и может быть искажено, периферия же может быть целиком сложена заново. Располагая единственной прародительской структурой, можно относительно достоверно моделировать консервативную часть исследуемого белка, но построить модель вариабельной части уже не удастся. Более того, непросто предсказать, какие участки являются вариабельными, а какие — консервативными. Более предпочтительна ситуация, когда несколько родственных белков с известной структурой могут выступать в качестве родителей для моделирования по гомологии. Они выявляют внутри семейства участки с консервативной и вариабельной структурой. Наблюдаемое распределение структурной вариабельности среди родительских структур диктует подходящее распределение ограничений применительно к моделированию [4].
Развитое программное обеспечение для моделирования по гомологии доступно.
SWISS-MODEL — это Web-сайт, который принимает на входе аминокислотную последовательность исследуемого белка, определяет, существует ли подходящая для моделирования по гомологии родительская структура (структуры), и, если существует, выдает на выходе набор координат исследуемого белка. SWISS-MODEL разработали Т. Schwede, М. С. Peitsch и N. Guex в Женевском институте биомедицинских исследований [4, 12, 13].
В зависимости от сложности задачи, которую необходимо решить при моделировании пространственной структуры белка, интересующего исследователя, на сайте SWISS-MODEL может быть использован один из трёх возможных алгоритмов действия: автоматическое моделирование, «способ выравнивания» и «проектный способ». Эти способы отличаются по степени участия пользователя в процессе [4, 12].
1. Автоматическое моделирование подходит в тех случаях, когда имеется достаточно высокая степень сходства между исследуемым белком и белком, выступающим в роли матрицы (образца для сравнения). Как правило, если целевой белок и матрица имеют более 50 % идентичности в последовательностях, то автоматические «выравнивания» последовательностей являются достаточно надежными [12].
Для подачи запроса требуется только наличие аминокислотной последовательности целевого белка или кода доступа (если последовательность данного белка хранится в базе UniProt) в качестве вводимых данных. Программный пакет сервера автоматически выберет подходящие матрицы, используя предел величины Е (E-value limit) из Blast, экспериментальные данные, данные о связываемых молекулах субстратов или различные конформационные состояния белка-матрицы [12].
В зависимости от того, как планируется применять получаемую модель, обязательно нужно выбрать белок-матрицу в правильной конформации. Для чёткого определения структуры белка-матрицы пользователь может предоставить id из ExPDB), например, 1akeA, где PDB-ID - 1ake, Chain ID – А [12].
Примером автоматического предсказания с помощью SWISS-MODEL является предсказание структуры трансмембранной протеазы 3 человека (TMPRSS3).
Типичные этапы эксперимента по моделированию:
(a) Представление в «ленточной» форме трёх доменов, смоделированных для целевого белка – трансмембранной протеазы 3 человека (TMPRSS3): I, LDL рецепторный домен и II, рецептор – связывающий домен в комплексе с протеазным доменом.
(b) программа IprScan последовательности целевого белка позволила обнаружить три домена в целевом белке.
(c) поиск, основанный на аминокислотной последовательности, в библиотеке матриц показал наличие двух сегментов с подходящими матричными структурами
(d) Представлены вторичная структура и предсказание неупорядоченности целевого белка
(e) на графике представлена величина «anolea», позволяющая оценить качество окончательной модели.
• «Способ выравнивания» позволяет пользователю проверить несколько альтернативных выравниваний и оценить качество полученных моделей для достижения оптимального результата. «Способ множественных выравниваний» последовательности является общим средством во многих молекулярно-биологических исследованиях. Если трехмерная структура известна, по крайней мере, хотя бы для одного из родственных белков, то это выравнивание может быть использовано в качестве исходной точки для сравнительного моделирования на основе «способа выравнивания» [12].
Для облегчения использования «способа выравнивания» в различных форматах, подача данных осуществляется как трехэтапный процесс:
1. Подготовка множественного выравнивания последовательности:
• Запрос должен содержать, по крайней мере, целевую последовательность и последовательность белка-матрицы
• Нужно использовать любое из возможных средств выравнивания, например, T_COFFEE (Cedric Notredame)
• Убедиться в том, что у последовательностей "разумное" названия
2. Необходимо предоставить «выравнивание» на «рабочее место», где также указывается использованный «способ выравнивания».
• Возможные форматы: FASTA, MSF, CLUSTALW (рисунок 5), PFAM and SELEX
• Можно либо загрузить файлы, либо скопировать и вставить последовательности
• Обязательно нужно правильно указать формат выравнивания,
Рисунок 2. 2. 5 - «Выровненная» последовательность белка с использованием программы CLUSTALW
3. Выбрать целевой белок и белок-матрицу
• Выравнивание (в той форме, какой оно было интерпретировано сервером) должно отражаться в нижней части страницы
• Сценарий программы самостоятельно попытается определить правильные названия, основываясь на данных, предоставленных пользователем;
• Выбрать название той последовательности, которая является целевой (target template)
• Выбрать название последовательности, которая будет являться матрицей (template sequence, например, 1crnA), при этом совсем не обязательно в качестве названий использовать ID из PDB, можно использовать названия, которые нравятся пользователю.
• Необходимо определить структуру матрицы, которой принадлежит эта последовательность. Эта матрица обязательно должна быть частью библиотеки матриц ExPDB, поэтому необходимо воспользоваться библиотекой матриц SWISS-MODEL
• Также необходимо указать правильное название ID цепи белка-матрицы, необходимо отметить, что названия цепей должны быть указаны заглавными буквами.
Рисунок 2.2.6 - Правильно заполненная форма запроса
Сверху указано название целевой белковой последовательности, внизу последовательности-матрицы, далее располагается PDB ID белка-матрицы (1 crn в данном случае), в приведенном примере не указывается цепь белка-матрицы для анализа
4. Проверка выравнивания и подтверждение запроса
• «Выравнивание» внизу страницы должно представлять правильное отображение структуры матрицы по отношению к целевой последовательности. Это необходимо тщательно проверить перед подтверждение запроса.
• Обычно необходимо предоставить адрес электронной почты для оформления заявки на SWISS-MODEL.
Сервер построит модель исключительно на основе «выравнивания» [12].
• «Проектный способ»: используется в тех случаях, когда правильное «выравнивание» между целевым белком и матрицей не может быть определено на основе метода последовательностей, визуальная проверка и ручная обработка «выравнивания» может существенно помочь улучшить качество модели, получаемой на выходе. Файлы «проектного способа» содержат матричные структуры и «выравнивание» между целевым белком и матрицей. Данные файлы формируются при помощи программы DeepView (Swiss-PdbViewer) или средств выбора матриц, которые имеются в рабочей области. Файлы «проектного способа» предоставляются на выходе в формате, заданным по умолчанию моделирующим сервером, что позволяет анализировать и каждый раз улучшать модели, сгенерированные при помощи «автоматического моделирования» и «способа выравнивания» [12].
|
