На правах рукописи
Агафонов Александр Петрович
Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций
03.01.06 – биотехнология
03.02.02 - вирусология
Автореферат диссертации
на соискание ученой степени доктора биологических наук
Новосибирск, 2010
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России
Научный консультант
|
доктор медицинских наук,
профессор Дроздов Илья Геннадиевич
|
Официальные оппоненты:
|
доктор биологических наук Аликин Юрий Серафимович
|
доктор медицинских наук,
профессор Носик Дмитрий Николаевич
|
доктор медицинских наук,
профессор Трунов Александр Николаевич
|
Ведущая организация
|
Филиал Федерального Государственного Учреждения
«48 Центрального Научно-Исследовательского Института Министерства Обороны Российской Федерации» – «Вирусологический Центр», Московская область, г. Сергиев Посад-6
|
Защита состоится « 24 » декабря 2010 г. в______часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (383)336-74-28.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Автореферат разослан «____»______________2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета д.б.н. Г.П. Трошкова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Актуальность проблемы. Борьба с инфекционными заболеваниями – одна из наиболее актуальных и приоритетных задач современного здравоохранения. Болезни, вызываемые инфекционными агентами, во многих странах являются главной причиной преждевременной смерти. Смертность от инфекционных заболеваний характерна, главным образом, для населения развивающихся стран, однако и в странах с высоким уровнем здравоохранения мероприятия по снижению уровня инфекционных заболеваний входят во все национальные программы социальной и медицинской направленности (WHO, 2008; WHO, 2009).
Реализация программы искоренения натуральной оспы, успехи в борьбе с полиомиелитом и корью доказывают возможность эффективной борьбы и даже полной элиминации инфекционного заболевания. Проверенный практикой комплексный подход, включающий в себя сочетание профилактики и эпидемиологического контроля, становится условием борьбы с инфекционным заболеванием и залогом успеха. При этом крайне важно на первых этапах исследования получить сам этиологический агент и его антигенные компоненты и изучить их структурно функциональные и иммунобиологические свойства.
На сегодняшний день корь, наряду с малярией, туберкулезом, ВИЧ/СПИД, холерой, эпидемическим паротитом, краснухой, остается наиболее распространенным инфекционным заболеванием в мире (WHO, 2008; WHO, 2009). Программой ВОЗ определена задача усиления надзора над заболеванием и ликвидации кори.
Приказами МЗ РФ от 19.08.2002 № 270 «Об утверждении программы ликвидации кори на территории Российской Федерации к 2010 году» 21.03.2003 № 117 «О реализации "Программы ликвидации кори в Российской Федерации к 2010 году"» в рамках программы ВОЗ усиления надзора над заболеванием и ликвидации кори была принята национальная программа элиминации кори. Для ее успешной реализации организованы работы по молекулярно-эпидемиологическому мониторингу за инфекцией и разрабатываются эффективные тест-системы для подтверждения случаев заболевания и серомониторинга кори в России. В 2009 заболеваемость корью в РФ снизилась до уровня менее 1 случая на 1 млн. населения, что позволило 2010 году завершить национальную Программу ликвидации кори, и начать процедуру подготовки сертификации территорий для документального подтверждения статуса субъектов РФ как территорий, свободных от эндемичной кори (Гос. доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в РФ в 2009 году», 2010; Приказ Роспотребнадзора №308, 2010).
С одной стороны это подтверждает эффективность мероприятий вакцинопрофилактики в борьбе с инфекциями, с другой – указывает на незащищенность населения от других вирусных инфекций, средства профилактики для которых еще не разработаны. Неконтролируемые инфекции представляют биологическую опасность для России и с точки зрения возможного завоза на территорию эндемичных вирусов при расширяющихся экономических и туристических связях в мире, и с точки зрения умышленного использования инфекционного агента. Особую опасность для человека из-за своей высокой контагиозности и патогенности представляют возбудители вирусных геморрагических лихорадок. Вирусы, вызывающие заболевания с геморрагическим синдромом, относятся главным образом к четырем семействам: Filoviridae, Arenaviridae, Bunyaviridae и Flaviviridae. К наиболее опасным, с точки зрения последствий для не эндемичных территорий, можно отнести представителей семейства Filoviridae – вирусы Марбург и Эбола, летальность от которых составляет 80-90 %. Если учесть увеличение скорости передвижение людей, использующих современные виды транспорта, расширяющиеся связи между государствами, а также высокую контагиозность вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки, то опасность заноса инфекции на не эндемичные территории и возникновение там вспышек с серьезными последствиями становится вполне реальной. Следует учитывать, что для многих возбудителей геморрагических лихорадок четко не определены ни ареалы распространения, ни резервуары инфекции, ни переносчики и способ передачи. В настоящее время для борьбы с этими инфекциями не разработаны эффективные средства профилактики и лечения.
Цель работы получение вирусных антигенов и изучение их иммунобиологических свойств для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций: геморрагической лихорадки Марбург, кори и эпидемического паротита.
Задачи исследования:
Разработка технологии получения очищенных вирусов из культуральной вируссодержащей жидкости с целью получения антигенов для изучения иммуногенных свойств или разработки современных ИФА-тест-систем в соответствии с принципами обеспечения биологической безопасности в вирусологических лабораториях.
Получение антигенов вируса Марбург, изучение их иммуногенных и протективных свойств и определения антигенов, перспективных для создания вакцины против геморрагической лихорадки Марбург.
Оценка перспективности современных подходов к созданию профилактических препаратов против кори – изучение иммуногенности экспериментального препарата на основе живого вируса кори при пероральном его применении и ДНК-вакцины.
Выделение и изучение циркулирующих на территории России вирусов кори и паротита с целью слежения за их антигенной и генетической изменчивостью и создания на их основе диагностических ИФА-тест-систем.
Научная новизна и практическая значимость работы
Разработана и запатентована технология получения вирусных антигенов для создания профилактических и диагностических препаратов (патенты RU2029561C1, RU2230785C2, RU2348691C1). Получены и охарактеризованы по иммуногенным и протективным свойствам структурные белки вируса Марбург, которые могут быть использованы при разработке диагностических и профилактических препаратов против геморрагической лихорадки Марбург. Показана принципиальная возможность создания удобного в применении и более простого с точки зрения организации профилактических мероприятий варианта коревой вакцины – препарата для перорального применения. В рамках реализации программы глобальной ликвидации кори разработаны эффективные ИФА-тест-системы для диагностики кори и проведения мероприятий по серомониторингу заболевания, а также изучены антигенные свойства циркулирующих на территории Западной Сибири генотипов вируса. Впервые в РФ разработана и внедрена в практику здравоохранения тест-система иммуноферментная для определения антител класса G к вирусу кори, позволяющая оценить содержание антител класса G в международных единицах. Впервые в РФ разработана тест-система иммуноферментная для определения антител класса М к вирусу кори. Исследования по серомониторингу заболевания позволили выявить возрастные группы населения, наиболее подверженные опасности заболевания корью. Подтверждено генетическое и антигенное родство новых генотипов вируса кори и вируса паротита с вакцинными штаммами, используемыми для программы вакцинопрофилактики этих заболеваний. Впервые показана циркуляция генотипа D6 вируса кори и генотипов C и H вируса паротита на территории РФ.
Штамм Popp вируса Марбург депонирован в Государственной коллекции вирусов (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН) под номером ГКВ N 946 от 20 января 1993 г. Штамм рекомендован для производства диагностических и вакцинных препаратов. Штаммы вирусов кори и паротита депонированы в коллекции микроорганизмов ГНЦ ВБ Вектор (штамм «НовО/96» вируса кори – VB-04, штамм «Драгун» вируса паротита – VB-05, штамм «ПетроНов» вируса паротита – V-330) и использованы для получения антигена – основного компонента ИФА-тест-системы.
Апробация работы
Результаты исследований были доложены: на международной конференции "Медицина, биотехнология, иммунизация и СПИД" (Ленинград, 1991), международном симпозиуме "100 лет вирусологии" (Москва, 1992), международной конференции 100-летие вирусологии (Санкт-Петербург, Россия, 1992), IX (Глазго, 1993), X (Иерусалим, 1996), XII (Париж, 2002) международных вирусологических конгрессах, 2-й, 3-й и 4-й международных конференциях «Новые направления в развитии вакцин» (Вена, Австрия, 1995, 1997, 1999 гг.), международной конференции «Вирусы Марбург и Эбола» (Марбург, Германия, 2000), 11-м международном конгрессе по инфекционным заболеваниям (Канкун, Мексика, 2004), IX международной конференции «Новые технологии в медицине и экологии» (Гурзуф-Ялта, 2001), международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, 2003), международной конференции по медико-биологическим исследованиям (Мюнхен, 2004), Азиатском конгрессе по аэрозолям (Гонконг, 2004), VI межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств – участников Содружества Независимых Государств: проблемы биобезопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), IX Съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2006), II и III Российских научных конференциях с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002 и 2006), международной научно-практической конференции «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития» (Алматы, Республика Казахстан, 2008).
Работа выполнена в 1990–2009 годах в ГНЦ ВБ "Вектор" в рамках научных тем организации и по грантам МНТЦ (1035В, 2168). Работы по оценке иммуногенности живой коревой вакцины при пероральной аппликации были проведены в лаборатории профессора A.D.M.E. Osterhaus (Университет им. Э. Роттердамского, Роттердам, Нидерланды). Изучение штамма НовО/96 вируса кори было проведено в лаборатории кори и краснухи д-ра E. Gerike (Институт им. Р. Коха, Берлин, Германия). Основные положения, выводы и практические предложения диссертации были обсуждены и одобрены на заседании проблемно-тематической комиссии «Эпидемиология, вирусология и диагностика особо опасных вирусных инфекций» ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (2010).
Основные положения, выносимые на защиту
Белок NP вируса Марбург обладает выраженными иммуногенными свойствами и вызывает образование вирусспецифических антител и развитие клеточного иммунитета, формируя протективный иммунный ответ при введении лабораторным животным.
Вакцинный штамм вируса кори способен вызывать формирование специфического гуморального и клеточного иммунного ответа у лабораторных животных при пероральном применении.
Введение лабораторным животным ДНК-вакцины на основе гемагглютинина вируса кори приводит к формированию специфического гуморального и клеточного иммунного ответа.
Наибольший процент лиц, не имеющих протективных антител к вирусу кори, входит в возрастную категорию населения РФ от 16 до 25 лет.
Циркулирующие на территории РФ в период с 1993 по 2001 гг. вирусы кори и паротита находятся в близком антигеном родстве с вакцинными штаммами, используемыми для программы вакцинопрофилактики.
Публикации результатов исследований
По теме диссертации опубликовано 31 научная статья, в том числе 23 статьи в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации, 3 монографии, 1 методические указания. Получено 4 патента Российской Федерации.
Внедрение результатов исследований
Предложены и апробированы методы получения вирусных антигенов, послужившие основой для разработки средств диагностики в рамках выполнения Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы)».
Внедрена в практику здравоохранения тест-система иммуноферментная для определения антител класса G к вирусу кори с представлением содержания антител в международных единицах. Совместно с ЗАО «Медико-биологический союз» выпущено и поставлено потребителям 8 серий тест-системы «Корь-IgG-ДС», достаточных для проведения более 80 000 анализов.
Материалы диссертации используются, в том числе и в учебно-образовательном процессе при проведении курсов повышения квалификации специалистов микробиологических лабораторий Министерства здравоохранения и социального развития РФ и Министерства сельского хозяйства РФ на базе в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 334 страницах машинописного текста, включает 46 таблиц и 57 рисунков и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы, содержащий 380 работ отечественных и зарубежных авторов.
Материалы и методы исследований
В работе использовали вирус Марбург (штамм Рорр), полученный из БелНИИЭМ (Минск, Беларусь). В качестве референс-штаммов при работе с вирусом кори был использован штамм Эдмонстон (получен из АТСС, VR-24), при работе с вирусом паротита – штамм Эндерс (получен из АТСС, VR-106). При оценке антигенных свойств выделенных изолятов вирусов кори и паротита использовали вакцинные штаммы Л-16 и Л-3, полученные из Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского (Москва). В качестве тест-вируса для титрования интерферона использовали вирус энцефаломиокардита мышей (ЕМС), полученный из коллекции штаммов вирусов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва).
Использовали клетки Л-68, ДК-58 (диплоидные фибробласты эмбриона человека), К-562 (клетки миелолейкоза человека), СV-1, Vero, GMK (клетки почки обезьяны), клетки комара Aedes aegipty и L-929 (клетки мыши) получены из коллекции культур клеток ГНЦ ВБ «Вектор». В работе использовались питательные среды RPMI-1640, ПС-4, Игла МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов производства ГНЦ ВБ «Вектор».
В исследованиях использовали аутбредных морских свинок (вес 250-300 г), кроликов (вес 1,5-2,5 кг), мышей линии BALB/c (вес 14-18 г), обезьян Macaca mulatta (самцы 5,2-6,6 кг) и Papio hamadrias (самцы 4,8-5,2 кг), полученных из питомника ГНЦ ВБ «Вектор». Животные содержались на стандартном рационе с достаточным количеством воды. Все манипуляции с животными при поведении эксперимента проводили с применением седативных средств в соответствии с ветеринарным законодательством.
Для идентификации вируса Марбург использовали референс-сыворотку (сыворотка реконвалесцента N 700808), которая была получена из CDC (Атланта, США). Анализы по определению уровня специфических антител к вирусу кори стандартизовались относительно международного образца «1st International Standard, 1990, Anti-Measles antibody 66/202, 5 International Units per ampoule». Разработанные тест-системы были сравнены с коммерческими тест-системами, производства ЗАО “Биосервис” (Москва), Wampole (США), Boehringer Mannheim (Германия), Human (Германия). Образцы с известным титром ревматоидного фактора (по латекс-тесту) для панели содержащей и не содержащей антитела класса М к вирусу кори были любезно предоставлены к.б.н. Т.Н. Юнасовой (лаборатория кори, паротита, краснухи и интерферонов, рук. проф. В.Ф. Попов, ГИСК имени Л.А. Тарасевича).
Препараты очищенных вирусов Марбург, кори, паротита анализировали с помощью электронной микроскопии, электрофореза в ПААГ по Лаемли (Laemly W.K, 1970), вестерн-блот анализа (Towbin H. et al., 1976), а концентрацию общего белка в препаратах определяли традиционным методом Лоури (Lowry O. H. et al., 1951).
Оценку показателей гуморального иммунитета проводили: для вируса Марбург методом ИФА по ранее описанной методике (Becker S. et al., 1992), для вируса кори и паротита – методом РТГА, используя эритроциты обезьяны (Попов В.Ф. и др., 1985), методом ИФА, используя коммерческие тест-системы, и в реакции нейтрализации (CDC, 1996). Оценку клеточного звена иммунитета проводили с использованием реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ), которую проводили по общепринятой методике (Ignatyev G.M. et al., 1995), методом ELISpot с использованием набора «ELISpot mouse INF-γ» (R&D Systems Inc, США) и исследуя активность CD3, CD4, CD69 и CD8 клеток (Stittelaar K. et al., 2000). Протективные свойства препарата оценивали по индексу резистентности, который вычисляли как разницу логарифмов ЛД50 в опыте и контроле. Статистическую обработку данных проводили с использованием непараметрических методов оценки: сравнение по χ2 критерию, сравнение по U критерию Манна-Уитни (Закс Л., 1976). Значение ЛД50 находили по формуле Кербера в модификации И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962).
Для разработки ИФА-тест-систем использовали выделенные от больных штамм NovO/96 вируса кори (патент RU № 2230785 C2) и штамм Драгун вируса паротита (патент RU 2348691 С1).
Исследования с участием людей проводили с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 Т2288, Федеральные законы №30-ФЗ от 02.03.1998, № 214-ФЗ от 20.12.1999). Порядок проведения исследования одобрен этическим комитетом IRB00001360.
|
